2021-2022学年高中生物苏教版选修一资源备课参考：4-2 分子生物学技术 .docx

1、第二节分子生物学技术教学建议教师在导入本节课的学习时,可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及PCR的应用,以激发学生的学习兴趣,然后再说明本节课的目标。关于PCR原理的理解,需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。教师在教学过程中,可以首先引导学生回忆必修2遗传与进化中的有关DNA复制的知识。在此基础上,学生需要进一步了解DNA双链的方向,能够区分DNA的3端和5端。此外,学生还需要了解DNA聚合酶的特性,如只能从DNA的3端开始延伸DNA链,而不能从头合成DNA等。Taq聚合酶的应用,解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题,促成了PCR技术的自动化,是一个重要的知识点。教师可以

2、结合“分离特定的微生物并测定其数量”了解Taq细菌的发现过程,帮助学生加深理解。关于PCR的反应过程应以读图识图为主。教材中的图“聚合酶链式反应程序示意图”详细地描绘了参与PCR的各组成成分;每一轮反应的三个基本步骤变性、退火和延伸;每一轮中每一个步骤所发生的变化,即每个步骤所具有的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时,结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时,教师要及时给予解答。本节“目的DNA片段的体外扩增”实验,教师可在实验前讲请注意事项,再分组操作,以保证实验成功。实验结束后教师要指导学生分析成功或失败的原因。参考资料PCR出现假阴性和假阳性分析1.假阴性:不出

3、现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量及活性,PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。(1)模板:模板中含有杂蛋白质;含有Taq酶抑制剂;模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白;在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。(2)酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。(3)引物:引物的质量、浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失

4、败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增;引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。(4)Mg2+浓度:Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。(5)物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。(6)模板DN

5、A变异:如模板DNA发生突变影响引物与模板特异性结合,或缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。2.假阳性:出现非特异性扩增带(1)引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。(2)靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要

6、时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。(3)空气中的小片段核酸污染:这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性,可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。3.PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带:非特异性条带的出现的原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物。降低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93 变性,65 左右退火与延伸)。4.出现片状拖带或涂抹带:PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量,减少循环次数。