石斑鱼病毒性神经坏死病防治的研究现状.pdf

1、石斑鱼病毒性神经坏死病防治的研究现状魏盟智李亚军安鑫龙邓晓东摘要：主要综述了病毒性神经坏死病的基本特征、诊断技术等研究进展介绍了神经坏死病毒的防控技术及策略简单概述了在石斑鱼养殖过程中病毒性神经坏死病的防控工作。关键词：石斑鱼（Epinephelus sp.）;病毒性神经坏死病;病害防控1 我国石斑鱼养殖和神经坏死病发病现状石斑鱼（Epinephelus sp.）是鲈形目（Perciformes）、石斑鱼属（Epinephelus）鱼类的总称为暖水性礁栖鱼类。石斑鱼体色色彩斑斓艳丽肉质鲜美营养全面均衡同时鱼肉低脂肪、高蛋白是不可多得的上等食用鱼。我国人工养殖石斑鱼始于 1980 年1目前石斑鱼

2、养殖地区主要在沿海省份中的广东、广西、福建、浙江、海南五个省。随着时间的推移在石斑鱼养殖过程中发现病毒性神经坏死病危害严重最严重时可导致养殖鱼苗在一周内全部死亡。鱼类病毒性神经坏死病是由于神经坏死病毒（Nervous necrosis virusNNV）入侵鱼体导致石斑鱼脑、视网膜、鱼中枢神经等神经系统坏死的病毒由该病毒引起的石斑鱼病毒性神经坏死病主要发生在石斑鱼的稚鱼期和幼鱼期。2 神经坏死病毒神经坏死病毒（Nervous necrosis virusNNV）是诺达病毒属（Betanodavirus）的一种2。于 1997 年 Nishizawa 等人对 25 种 Betanodavirus

3、 病毒外壳蛋白基因所包含的部分核苷酸序列的同源性进行分析比对最终将其分为 4 种血清型，即 tiger puffernervous necrosis virus（TPNNV）、striped jack nervous necrosis virus（SJNNV）、red-spotted grouper nervous necrosis virus（RGNNV）和 barfinflounder nervous necrosis virus（BFNNV）3-4。3 检测、诊断技术3.1 表型观察石斑鱼患该病毒症后主要表现症状为身体发黑、腹部肿胀向上漂浮在水面、在水面狂游或呈螺旋状游泳、厌食甚至停食、

4、死亡。解剖病鱼发现处于发病初期的鱼脾脏鲜红随病情加重逐渐肿大、发黑或呈暗红色。病鱼肝脏呈土黄色或萎缩状鱼鳔有胀气现象病鱼脑组织颜色有变红现象病鱼的肾脏器官坏死、糜烂。鱼体头大而身小、形体消瘦1。3.2 免疫学诊断技术利用免疫学的技术方法可以比较快速地进行诊断如酶联免疫吸附测定试验（ELISA）可以利用具有专一性的抗原和抗体进行检测可以检测到病鱼組织内存在的少量或微量抗原灵敏度较高但是由于某些外在因素影响往往导致 ELISA 的特异性结合不稳定容易呈现出假阳性结果。目前在 NNV 的检测领域中虽然已经被应用但是在逐步地被分子生物学的检测方法取代。如 Watanabe 等人通过该方法对条斑星鲽亲鱼

5、进行检测结果表明当 ELISA 的抗体检测不超过 40 滴度时利用该方法筛选出没有携带病毒粒子的健康亲鱼利用经过筛选的条斑星鲽亲鱼进行繁殖其产生的后代仔鱼基本不发病5。3.3 分子生物学检测技术利用分子生物学技术进行检测特别是 PCR 法可以有效、便捷地检测到病毒是否存在。随着研究层次的逐渐深入生物技术的不断提高已经衍生出多种多样的 PCR 检测方法。刘荭等设计出四种引物采用 RT-PCR 的检测方法来鉴别出四种基因型各不相同的神经坏死病毒6;陈信忠等利用 RT-PCR 检测技术成功地在 5 种养殖的石斑鱼中扩增出 NNV RNA2 条带7;Mu 等在 25%40%的健康斜带石斑幼鱼中检测到了

6、 NNV 粒子8;陈晓燕等利用 PCR 技术对斜带石斑鱼神经坏死病毒粒子的外壳蛋白基因进行克隆和序列分析证明了该病毒株是RGNNV 血清型的成员9。利用 PCR 技术检测时可以极大地缩短技术人员的操作时间操作简单便捷并且所得结果基本有效。其中 LAMP 检测方法可以使操作过程不需要某些特定设备且时间在 12 h 内目前这种技术已经被普遍应用在病毒检疫防控领域10。细胞培养技术也是诊断石斑鱼患病情况的技术之一它利用对病毒比较敏感的某些细胞系或者细胞株进行人工培养而后进行鉴定、分离以及确诊。使用电子显微镜观察切片时找到与病鱼组织中含有的相同的病毒颗粒再将利用细胞培养技术培养出来的病毒颗粒对健康鱼个

7、体进行回接感染后出现相同症状。如林楠等利用细胞培养技术对福建漳州市石斑鱼鱼苗进行病原的分离与鉴定11;蒋方军等利用细胞系培养进行鱼类神经坏死病毒的分离12。但是细胞培养技术难度大、耗时长不适合养殖基地现场检测但却是细胞学、免疫学等领域非常重要的技术手段。4 病毒传播途径神经坏死病毒的传播途径可以分为两种：第一种是通过亲鱼传向仔鱼的垂直传播。第二种是通过水体、饵料、水草等养殖环境的水平传播2-3。垂直传播是由携带该病毒的石斑鱼产卵此时卵中带有神经坏死病毒粒子待卵孵化为仔鱼时爆发病毒性神经坏死病。筛选不携带病毒的健康鱼体是切断垂直传播的主要途径Watanabe 等利用 PCR 技术同时结合 ELI

8、SA 技术对石斑鱼亲鱼中是否含有该病毒粒子进行检测然后将筛选得到的不携带病毒粒子的亲鱼繁殖获得不携带病毒的鱼卵发现亲鱼所产生的后代仔鱼不容易患有病毒性神经坏死病。因此他们认为筛选出健康不携带病毒粒子的亲鱼是切断垂直传播的有效手段5。水平传播是由于在养殖水体中有病毒粒子的存在或鱼苗中有携带病毒粒子的个体它们释放病毒粒子附着在水中、饵料上、水草上或直接接触其他个体从而传播疾病。Gomez 等分离出饵料杂鱼中所携带的 NNV 病毒粒子利用健康的七带石斑鱼（E.septemfasciatus）对细胞培养出的 NNV 粒子进行回接感染试验在两周后发现健康石斑鱼的鱼脑及鱼神经中出现了同样的病毒颗粒并且造成

9、该批试验用鱼 90%以上的死亡率说明了在饵料杂鱼中含有的病毒是可以感染健康鱼体的13;Manin 等把两种鱼的幼鱼浸泡在病鱼的匀浆液中之后对全部的幼鱼进行检测结果发现全部个体都含有 NNV 表明 NNV 可以利用水平传播为其传播途径14。所以在养殖中需要及时对养殖水体进行消毒减少密度注意水体变化。5 防治途径5.1 物理防控目前关于神经坏死病的防治报道比较少能够有效抑制病毒扩散提高鱼苗成活率的方法不多。主要需警惕该病毒的垂直传播应选择健康无病亲鱼的后代;及时清理鱼塘中的垃圾、残饵;定时投喂益生菌等加强鱼类免疫力;适当降低养殖密度。5.2 免疫防控疫苗免疫是目前最重要、最有效的免疫手段之一。且在

10、海水鱼病毒性疾病研究中已经有比较多的成果。比如在赤点石斑鱼仔鱼、幼鱼中通过注射疫苗的方式证明注射 NNV 疫苗可以使幼鱼成活率提高约 67%15-16。朱建蕊等利用大肠杆菌表达 NNV 的衣壳蛋白投喂黄粉虫并利用黄粉虫喂养石斑鱼从而提高了石斑鱼感染 NNV 后的成活率17;Lu 等利用转化后的大肠杆菌表达 NNV 外壳蛋白从而获得类病毒颗粒产生的该种病毒颗粒能在鱼类神经表面与 NNV 病毒粒子争抢结合点这样就极大地抑制了病毒侵入石斑鱼神经细胞使病毒入侵细胞的效率大大降低对宿主起到了很好的保护作用18;Sommerset 等将病毒外壳蛋白重组进行免疫发现当使用量为 10 g 时重组蛋白具有较好免

11、疫保护效果19。然而在实际养殖过程中处于病毒性神经坏死病爆发期的仔鱼、幼鱼的特异性免疫系统还没有发育或还没有发育成熟并不能起到特异性免疫的效果。所以关于如何有效使海水鱼类产生免疫保护的防治技术仍需要深入研究。6 展望自我国海水鱼养殖业兴起后病害问题一直危害着产业的发展并且带来巨大损失。NNV对石斑鱼乃至海水鱼的鱼苗培育有着巨大的威胁如何解决 NNV 如何防控疾病是我国养殖业发展迫在眉睫、不可回避的重要课题。加强免疫检测筛选不携带病毒粒子的健康亲鱼注意水体健康切断病毒的垂直传播并有效抑制病毒的水平传播才能更好地防控疾病。参考文献：1赵平平.石斑鱼病毒性神经性坏死病研究现状J.黑龙江水产，2011

12、（05）：44-46.2 Nakai TMori KSugaya T，et al.Current knowledge on Viral nervousnecrosis（VNN）and its causative betanodavirusesJ.Isr J Aquacult-Bamid，2009，61（3）：198-207.3 陈信忠.石斑鱼病毒性神经坏死病研究D.厦门大学，2006.4 Nishizawa T，Furuhashi M，Nagai T，et al.Genomic classification offish nodaviruses by molecular phylogeneti

13、c analysis of the coat proteingeneJ.Applied and Environmental Microbiology，1997，63（4）：1633-1636.5 Watanabe K，Nishizawa T，Yoshimizu M，et al.Selection of broodstockcandidates of barfin flounder using an ELISA system with recombinant proteinof barfin flounder nervous necrosis virusJ.Dis Aquat Organ，200

14、0，41（3）：219-223.6 劉荭，史秀杰，高隆英，等.鱼病毒性神经坏死病病毒（VNNV）不同基因型鉴别方法的建立及在 VNN 检疫和监测中的应用J.水产学报，2004（06）：695-702.7 陈信忠，苏亚玲，龚艳清，等.逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 5 种养殖石斑鱼的神经坏死病毒J.中国水产科学，2004（03）：202-207.8 Mu Y，Lin K，Chen X，et al.Diagnosis of nervous necrosis virus inorange-spotted grouper，Epinephelus coioides，by a rapid and

15、 convenient RT-PCRmethodJ.Acta Oceanol Sin，2013，32（10）：88-929 陈晓艳，黄剑南，吕玲，等.斜带石斑神经坏死病毒外壳蛋白基因克隆与序列分析J.水产学报，2004（02）：183-188.10 黄文，陈偿，赵哲，等.海水养殖鱼类病毒性神经坏死病防控技术研究进展J.渔业研究，2016，38（05）：419-426.11 林楠，吴斌，李苗苗，等.石斑鱼病毒性神经坏死病的病原分离和鉴定J.福建农林大学学报（自然科学版），2019，48（04）：474-479.12 蒋方军.鱼类神经坏死病毒的分离和部分特性研究D.华中农业大学，2008.13 G

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17、inephelus fuscoguttatus fingerlingJ.Aquaculture，2011，321（1-2）：157-165.15 Yamashita H，Nakai T.The efficacy of inactivated virus vaccineagainst viral nervous necrosis（VNN）J.Fish Pathol，2005，40（1）：15-21.16 Pakingking R，Norwell-Brian B，Evelyn-Grace J，et al.Protectiveimmunity against viral nervous necros

18、is（VNN）in brown-marbled grouper（Epinephelus fuscogutattus）following vaccination with inactivatedbetanodavirusJ.Fish Shellfish Immun，2010，28（4）：525-533.17 朱建蕊，翟伟锋.NNV 衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用J.南方农业，2018，12（06）：112-114.18 Lu M，Liu W，Lin C，et al.Infection competition against groupernervous necrosis virus by

19、 virus-like particles produced in EscherichiacoliJ.J Gen Vir-ol，2003，84（Pt6）：1577-1582.19 Sommerset I，Skern R，Biering E，et al.Protection against Atlantichalibut nodavirus in turbot is induced by recombinant capsid proteinvaccination but not following DNA vaccinationJ.Fish Shell-fish Immun，2005，18（1）：13-29.（收稿日期：2020-05-06）