2023届高考二轮总复习试题 生物（适用于湖南、辽宁） 大题分析与表达练 6-基因工程类大题突破 WORD版含解析.docx

1、6.基因工程类大题突破1.(2022湖南师大附中二模)某人患有一种罕见的皮肤疾病,他的皮肤非常脆弱,轻微摩擦就会导致皮肤破损,继而感染各种病原微生物。医生检测发现他的LAMB3基因有2个碱基对错误,导致无法表达正常的层粘连蛋白。研究团队对他进行了基因治疗,取下他的一小块皮肤,在体外大量培养。然后利用逆转录病毒载体将正常的LAMB3基因插入细胞的基因组内,筛选出成功导入目的基因的细胞后,继续培养这些细胞,形成若干块单层“人造皮肤”,对他进行皮肤移植,最后他终于过上正常人的生活。(1)他经常感染各种病原微生物的原因是。(2)图中表示过程。过程将gag、pol、env等分离后需构建重组表达载体,并将

2、其导入小鼠胚胎细胞。过程中用到的工具酶分别是,过程常用的导入方法是。(3)天然的逆转录病毒RNA上有3组序列,A序列含有调节基因和启动子,调控病毒RNA的转移及表达;B序列编码逆转录酶、外壳蛋白等病毒蛋白质;C序列是包装信号序列,能被病毒蛋白识别,引发病毒的组装。操作中保留的LTR属于序列。过程中导入病毒的gag、pol、env序列的目的是。这种逆转录病毒载体作为一种基因表达载体,其优点是。(4)基因治疗的最大难度是要充分了解。2.(2022海南琼海三模)2020年中国政府提出“努力争取2060年前实现碳中和”的目标。发展利用生物能源是实现碳中和的有效途径。紫苏种子含大量油脂,出油率达35%6

3、4%,三酰甘油(TAG)是紫苏种子的主要储藏脂类,DGAT1是TAG合成的关键酶。科研人员将紫苏DGAT1基因导入微藻中,培养高产生物柴油的工程藻,如图所示。注:BamH和Hind是两种限制酶。回答下列问题。(1)从紫苏组织细胞中提取总RNA时,需要加入RNA酶抑制剂,目的是。将RNA逆转录合成的cDNA作为模板,PCR扩增DGAT1基因,反应体系中需加入酶,其作用是。为使DGAT1基因两端分别添加BamH和Hind识别序列,可将相应序列分别添加在两种引物的(填“5”或“3”)端。(2)构建DGAT1基因表达载体的目的是,使DGAT1基因能够表达并发挥作用。若只考虑DNA片段的两两连接,构建表

4、达载体时可得到种大小不同的连接产物。利用法将不同大小的DNA片段和连接产物分离,再将基因表达载体分离纯化,导入微藻细胞。(3)若鉴定微藻基因组中整合有DGAT1基因,(填“能”或“不能”)说明高产油工程藻已生产成功。理由是:(答出1点即可)。“碳中和”的含义是通过计算CO2的排放总量,然后通过植树等方式把这些排放量吸收掉。与使用石油等化石燃料相比,生产使用生物柴油有利于实现碳中和,原因是:。3.(2022河北石家庄三模)研究发现人溶菌酶(hLZ)是天然抗生素替代品。科学家培育出转入溶菌酶基因的山羊,可大规模生产人溶菌酶(从乳汁中提取)。其过程如下图所示,其中表示过程。亮氨酸是山羊细胞维持生命活

5、动必不可少的一种必需氨基酸,质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成控制亮氨酸的合成,基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题。限制酶BamHBglHindXba识别序列和切割位点5-GGATCC-35-AGATCT-35-AAGCTT-35-TCTAGA-3(1)以胞内的mRNA为模板通过反转录合成cDNA,将其储存于受体菌群,从而构建。过程需要的限制酶是。(2)为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞,质粒S中用作标记基因的是。为达到筛选目的,培养基的营养成分中不应含有。将成纤维细胞培养一段时间后观察,筛选出(填“显示”或“不显示”)绿色荧光的细胞用

6、于过程。(3)过程常用仪器为。培养过程中需对早期胚胎进行性别鉴定和胚胎分割,性别鉴定应取(填“滋养层”或“内细胞团”)进行SRY-PCR,筛选出雌性动物胚胎并进行分割,分割时应注意。4.(2022山东威海二模)COR基因是植物的冷调节基因,其编码的亲水性多肽能保护细胞免受冻害,具有增强植物抗寒性的作用。转录因子CBF(由CBF基因控制合成)能够特异性结合下游靶基因启动子区,从而激活COR基因的表达,以提高植物的抗寒性。将不同植物中获取的CBF基因和COR基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体,转入植物体内能有效提高植物的低温耐受性。构建基因表达载体时需要根据载体和目的基因上的限制酶切割位点选择不

7、同的限制酶,当遇到平末端和黏性末端不能连接时,可利用限制酶Klenow酶特有的53DNA聚合酶活性,将黏性末端补平后再与平末端连接。(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的长DNA片段,根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B,则在PCR反应过程中需要经过次复制才会出现与CBF基因长度和序列完全吻合的产物;经过四次循环形成的产物中同时含有A引物和B引物的DNA占。(2)抗寒相关基因超量表达依赖于适宜的启动子。启动子可分为组成型启动子(每种组织器官中均发挥作用)、组织特异型启动子(特定组织器官中才能发挥作用)和诱导型启动子(特定条件刺激下才能发挥作用),构建基因表达载体时可单独使用某

8、一类型的启动子,也可组合使用多种类型的启动子。从减少物质和能量消耗的角度出发,最好选择,使马铃薯块茎在寒冷刺激下才启动抗寒基因的表达。(3)为将COR基因表达载体和CBF基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体,应选择不同的限制酶分别切割COR基因表达载体和CBF基因的两端,目的是。根据下图所示的限制酶切割位点和识别序列,在实验室中构建抗寒基因超量表达载体时,为实现经Xba切割后的CBF基因与COR基因表达载体的连接,应选用的限制酶是。(4)转录因子CBF特异性识别下游靶基因启动子区后,可能与酶结合形成复合体,从而激活COR基因的表达。(5)科学家成功培育出抗寒基因超量表达的转基因植物后,筛选到一

9、个AtNUP160基因突变的植株(atnup160突变体),已知AtNUP160基因的表达产物能通过参与核孔复合体的形成影响RNA的出核转运,在植物的抗寒过程中发挥着重要的作用。研究发现,atnup160突变体中CBF基因的表达水平降低,进而影响了COR基因的表达,导致植物的抗寒能力减弱。由此推断atnup160突变体抗寒能力减弱的机理是:。5.(2022山东青岛一模)研究发现,斑马鱼性腺体衍生因子基因(gsdf)主要在精巢中表达。为研究gsdf相关分子的调控机制模型,科研人员构建了以Gamma-crystalin启动子(使相关基因在眼部晶状体特异性表达)启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧

10、光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp,部分构建过程如图1所示),最终成功获得表达gsdf基因的转基因斑马鱼。图1(1)科研人员提取斑马鱼精巢内的总RNA,经过程获得cDNA,并以其为模板,通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出gsdf基因的cDNA,其原因是。(2)图1中对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到种限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用双酶切的报告质粒载体中,最终通过一系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。(3)图1中的2A基因表达的2A肽序列具有“自剪切”的能力,将其置于质粒上gsdf基

11、因和egfp基因之间,可以避免这两个基因表达出一个融合蛋白。2A肽的“自剪切”原理如图2,字母G和P代表2A肽最末端的两个氨基酸。图2据图2推测,2A肽具有“自剪切”能力的原因是:。(4)某同学认为,gsdf基因在转基因斑马鱼眼部晶状体中特异性表达,就成功建立和获得了能稳定遗传的转基因斑马鱼模型。请对该同学的观点进行评价并说明理由。6.(2022山东青岛二模)基因定点突变是指按照特定的要求,使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图。图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。甲乙(1)图甲所示的基因定点突变技术需要进行多次PCR,并对PC

12、R的中间产物A、B进行纯化,据图分析,得到中间产物A、B需要的引物对分别是,至少要进行轮循环。研究人员利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段,长度(kb)如下表所示,则图中基因敲除片段的长度为,基因M1的长度为。底物基因MAB长度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05(2)基因M1进行PCR扩增时通常在反应缓冲液中添加Mg2+,原因是。鉴定PCR产物通常用法。(3)研究人员将基因M1与Ti质粒重构前,需要在基因M1的C、D两端分别加上的黏性末端序列为。构建重组质粒过程所需要的酶有。(4)重组质粒能够完成转化作用的原理是:。7.(2022山

13、东临沂三模)In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为1520 bp),然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为:质粒线性化;PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因;目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶的作用下形成重组质粒;将重组质粒导入受体细胞。(1)过程中需要用到的酶有。另外,利用处理也可以直接得到线性化质粒。(2)据图分析,为保证扩增出所需的目的基因,引物A或引物B要依据的碱基序列进行设计。过程经过轮循环即可初步得到符合要求的目的基因片段。(3)过程中

14、,同源序列1、2的碱基排序不同,这样设计的好处是。图示In-Fusion技术可作为模型使用,一般来说只需要改变图中的,即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。(4)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因,以大肠杆菌作为受体细胞时,过程需要用处理大肠杆菌。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果,在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间后,分别用显微镜计数法和法进行计数,若计数结果分别是M、N,则致死率可用(M-N)/M100%表示,此结果较真实值偏大,原因是。8.(2022山东淄博二模)由于乳酸菌难以在高密度下培养,研究人员将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酵母菌,通过酵母菌发酵生产乳酸。回答下列问题。图1

15、图2(1)采用PCR获取LDH时所用的引物是,该过程中引物的作用是。(2)将LDH基因插入质粒前,用EcoR和Apa酶切质粒和LDH,双酶切的优点是:,将LDH连接在质粒上所用的酶是。(3)首先将基因表达载体导入大肠杆菌并进行筛选,筛选时培养基中应加入。再将含有的基因表达载体的大肠杆菌与酵母菌置于电转杯中,通过电激将目的基因表达载体导入酵母菌。质粒在酵母菌中不会随着酵母菌的增殖而丢失,原因是。(4)图2是酵母菌发酵过程中乳酸含量的变化。在培养时间超过100 h后,乳酸浓度不再上升,主要原因是。为提高乳酸的生产效率,连续发酵时添加新培养基的最长周期为h。6.基因工程类大题突破1.答案:(1)皮肤

16、是保卫人体的第一道防线,可阻挡病原体入侵机体,若被破坏则各种病原微生物容易入侵人体(2)逆转录限制酶、DNA连接酶显微注射法(3)A合成组装病毒的蛋白质能将目的基因整合到受体细胞染色体中,使得目的基因能够稳定存在,并能表达和遗传给子代细胞(4)基因调控机制和疾病的分子机理解析:(1)根据题干信息“他的皮肤非常脆弱,轻微摩擦就会导致皮肤破损”,而由于皮肤是保卫人体的第一道防线,可阻挡病原体入侵机体,若被破坏则各种病原微生物容易入侵人体,所以他经常感染各种病原微生物。(2)逆转录病毒的遗传物质是RNA,在构建逆转录病毒载体时,需先获得含逆转录病毒全部遗传信息的DNA,故过程表示逆转录。过程中需要用

17、限制酶切割逆转录病毒的DNA分子和LAMB3基因,同时进行连接,所以需要限制酶、DNA连接酶;将重组DNA注入动物细胞的方法是显微注射法。(3)构建好的逆转录病毒载体可以将目的基因插入宿主细胞的染色体中,并且正常表达,故需要将目的基因插入A序列(A序列调控病毒RNA的转移及表达)之间,所以LTR为A序列。结合题图中操作将gag、pol、env分离后还需单独构建成一个载体,推测gag、pol、env属于B序列,目的是合成组装病毒的蛋白质。逆转录病毒载体与农杆菌Ti质粒的T-DNA作用类似,都能将目的基因整合到受体细胞染色体中,使得目的基因能够稳定存在,并能表达和遗传给子代细胞。(4)基因治疗的最

18、大难度是要充分了解基因调控机制和疾病的分子机理。2.答案:(1)防止RNA酶降解RNA耐高温的DNA聚合将游离的脱氧核苷酸连接到引物的3端,合成DNA子链5(2)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代3琼脂糖凝胶电泳(3)不能DGAT1基因在微藻细胞中不一定成功表达(或微藻细胞不一定产生TAG、微藻细胞出油率可能不高等)使用化石燃料只会排放CO2,产油工程藻生产生物柴油需要以CO2为原料解析:(1)从紫苏组织细胞中提取总RNA时,为避免RNA酶降解RNA,通常加入RNA酶抑制剂。将RNA逆转录合成的cDNA作为模板,PCR扩增DGAT1基因,反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,

19、该酶能将游离的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到引物3端,进而合成DNA子链。为使DGAT1基因两端分别添加BamH和Hind识别序列,需要将相应序列分别添加在两种引物的5端。(2)为了让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,需要构建目的基因表达载体,这是基因工程的核心步骤。若只考虑DNA片段的两两连接,构建表达载体时可得到3种大小不同的连接产物,即目的基因自连、质粒自连以及目的基因和质粒相互连接,由于它们的分子量有差别,因此,可利用琼脂糖凝胶电泳方法将不同大小的DNA片段和连接产物分离,再将基因表达载体分离纯化,导入微藻细胞。(3)若鉴定微藻基因组中整合有DGAT1基因,不能说明高

20、产油工程藻已生产成功,还需要检测DGAT1基因在微藻细胞中是否成功表达。“碳中和”的含义是通过计算CO2的排放总量,然后通过植树等方式把这些排放量吸收掉。与使用石油等化石燃料相比,生产使用生物柴油有利于实现碳中和,这是因为使用化石燃料只会增加排放CO2,产油工程藻生产生物柴油则需要以CO2为原料。3.答案:(1)cDNA文库BamH、Hind(2)基因Leu、基因GFP亮氨酸不显示(3)显微注射仪滋养层将内细胞团均等分割解析:(1)以胞内的mRNA为模板通过反转录合成cDNA,将其储存于受体菌群,从而构建cDNA文库;据图可知,目的基因两侧的黏性末端分别是5-GATC-3和5-AGCT-3,故

21、应选择限制酶BamH和Hind进行切割。(2)结合题意可知,质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成控制亮氨酸的合成,基因GFP控制合成绿色荧光蛋白,故质粒S中用作标记基因的是基因Leu、基因GFP;由于基因Leu可控制亮氨酸的合成,故为达到筛选目的,培养基的营养成分中不应含有亮氨酸;基因GFP可以控制合成绿色荧光蛋白,而BamH会破坏该标记基因,则在重组质粒中该基因不能发挥作用,故将成纤维细胞培养一段时间后观察,筛选出不显示绿色荧光的细胞用于过程。(3)过程是将目的基因导入动物细胞,常用方法是显微注射法,所用仪器是显微注射仪;由于滋养层将来发育为胎儿的胎膜和胎盘,故性别鉴定应取滋养层细胞;内

22、细胞团将来发育为胎儿的各种组织,胚胎分割时应注意将内细胞团均等分割。4.答案:(1)37/8(2)块茎组织特异型启动子和冷刺激诱导型启动子(3)保证COR基因表达载体和CBF基因的正确连接(避免CBF基因和COR基因表达载体的自身环化以及CBF基因的反向连接)Sam、Klenow酶(4)RNA聚合(5)atnup160突变体中AtNUP160基因的表达产物减少,影响核孔复合体的形成,导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出细胞核,转录因子CBF减少,使得COR基因的表达水平明显降低,导致保护细胞免受冻害的亲水性多肽的含量减少,使植物的抗寒能力减弱解析:(1)研究小组获取了一段包含CBF基因的

23、长DNA片段,根据已知CBF基因序列设计了适宜长度的引物A和引物B,则在PCR反应过程中需要经过3次复制才会出现与CBF基因长度和序列完全吻合的产物;经过4次循环,形成的产物共有24=16(个),其中含有亲代DNA分子母链的DNA分子共有2个,其他的DNA分子均共同含有引物A和引物B,则经过4次循环形成的产物中同时含有A引物和B引物的DNA占(16-2)/16=7/8。(2)抗寒相关基因超量表达依赖于适宜的启动子。启动子可分为组成型启动子(每种组织器官中均发挥作用)、组织特异型启动子(特定组织器官中才能发挥作用)和诱导型启动子(特定条件刺激下才能发挥作用),构建基因表达载体时可单独使用某一类型

24、的启动子,也可组合使用多种类型的启动子。为了达到减少物质和能量消耗的目的,应该选择块茎组织特异型启动子和冷刺激诱导型启动子,使马铃薯块茎在寒冷刺激下才启动抗寒基因的表达。(3)为将COR基因表达载体和CBF基因组合起来构建抗寒基因超量表达载体,应选择不同的限制酶分别切割COR基因表达载体和CBF基因的两端,这样可获得不同的黏性末端,保证COR基因表达载体和CBF基因的正确连接。根据图示限制酶切割位点和识别序列,在实验室中构建抗寒基因超量表达载体时,目的基因CBF的两端有两个限制酶Mun和Xba 的酶切位点,COR基因表达载体中有两个限制酶切点,其中Mun和Hed限制酶切割后能形成相同的黏性末端

25、,在DNA连接酶的作用下可实现连接,而Xba 切割CBF基因后形成的是黏性末端,无法与Sma切割后形成的平末端相连接,因此,需要在Xba 切割CBF基因后利用限制酶Klenow酶特有的53DNA聚合酶活性,将黏性末端补平后再与Sma酶切割后形成的平末端连接。(4)转录因子CBF特异性识别下游靶基因启动子区后,可能与RNA聚合酶结合形成复合体,从而激活COR基因的表达,因为RNA聚合酶能启动基因的转录过程。(5)科学家成功培育出抗寒基因超量表达的转基因植物后,筛选到一个AtNUP160基因突变的植株(atnup160突变体),已知AtNUP160基因的表达产物能通过参与核孔复合体的形成影响RNA

26、的出核转运,在植物抗寒过程中发挥着重要的作用。研究发现,atnup160突变体中CBF基因的表达水平降低,进而影响了COR基因的表达,导致植物的抗寒能力减弱。题意显示,atnup160突变体中AtNUP160基因的表达产物减少,影响核孔复合体的形成,导致CBF基因转录形成的mRNA无法转运出细胞核,转录因子CBF减少,使得COR基因的表达水平明显降低,导致保护细胞免受冻害的亲水性多肽的含量减少,使植物的抗寒能力减弱。5.答案:(1)逆转录引物是根据gsdf基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与gsdf基因的cDNA特异性结合)(2)3EcoR、Not(3)G与P之间未形成肽键(4)不合理。要

27、将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交,若后代能够表达gsdf基因,(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立解析:(1)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录,利用PCR技术扩增gsdf基因的cDNA,需要根据gsdf基因的一段已知序列设计引物,这样的引物能够在总cDNA中与gsdf基因的cDNA特异性结合,从而利用PCR扩增技术专一性扩增出gsdf基因的cDNA。(2)分析题图1可知,对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到3种不同的限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用EcoR、Not双酶切的报告质粒载体中,最终通过一系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。(

28、3)分析题意可知,将2A基因置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间,可以转录出一条mRNA,根据题图可知,翻译出gsdf蛋白之后,在G与P之间未形成肽键,继而开始合成egfp蛋白,从而避免这两个基因表达出一个融合蛋白。由此可知G与P之间未形成肽键是2A肽具有“自剪切”能力的原因。(4)要将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交,若后代能够表达gsdf基因,(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立。6.答案:(1)引物1和引物3、引物2和引物420.23 kb6.09 kb(2)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活琼脂糖凝胶电泳(3)TCGA、ACGTHind 、Pst、DNA连接

29、酶(4)Ti质粒上的T-DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上解析:(1)DNA复制时子链的合成方向为53,因此引物的方向为53,使用引物1和3可得到包含片段A的产物,使用引物2和4可得到包含片段B的产物;由于DNA进行半保留复制,使用引物1和3,进行一次PCR后,得到一个与基因M一样的片段,还得到一个含引物3的单链和一个长链的DNA片段,进行第二次PCR,得到4个DNA,其中有一个DNA片段,包含引物1和引物3,为图中的片段A,同理,片段B也可以经过两次PCR得到;图中表示酶切位点,基因M上有三个酶切位点,完全酶切产生4个片段,分别为3.24、2.8、0.15、0.13 kb,A片段酶切后

30、的片段长度为2.8、0.09 kb,B片段酶切后的片段长度为3.24、0.05 kb,图中A片段和B片段的是相同的,因此处为0.05 kb,则基因M1为2.8+0.05+3.24=6.09(kb),基因M为3.24+2.8+0.15+0.13=6.32(kb),因此基因敲除片段的长度为6.32-6.09=0.23(kb)。(2)PCR是体外进行DNA复制的过程,DNA复制需要DNA聚合酶,真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活,因此进行PCR扩增时通常在反应缓冲液中添加Mg2+;琼脂糖凝胶电泳通常用来鉴定PCR产物,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些,从而对不同大

31、小的DNA片段进行分离。(3)结合重组质粒可知,基因M1的C端为Hind、基因M1的D端为Pst,因此需要在基因M1的C、D两端分别加上Hind、Pst的识别序列,结合两种酶的酶切位点可知,黏性末端序列为TCGA、ACGT;DNA连接酶可以将目的基因和质粒的黏性末端进行连接,催化磷酸二酯键的形成,连成重组质粒。(4)Ti质粒与目的基因形成重组质粒,Ti质粒上的T-DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上,完成转化过程。7.答案:(1)Taq DNA聚合酶限制酶(2)目的基因和质粒3(3)防止目的基因反向连接;防止线性化质粒或目的基因的自身环化引物A和引物B(4)Ca2+稀释涂布平板在用稀释涂布

32、平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,在平板上观察到的是一个菌落解析:(1)据图可知,过程是利用两种引物进行的质粒线性化过程,该过程属于PCR技术的应用,故需要Taq DNA聚合酶;此外,也可利用限制酶切割相应的磷酸二酯键直接得到线性化质粒。(2)据图分析,目的基因经引物A或引物B扩增后需要与目的基因和线性化质粒连接,故为保证扩增出所需的目的基因,引物A或引物B要依据目的基因和质粒的碱基序列进行设计;根据DNA半保留复制的特点,可知PCR前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长,第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链,即仅含引物之间的序列,因此,至少经过3轮循环可得到符合要

33、求的目的基因片段。(3)过程是基因表达载体的构建过程,该过程中,同源序列1、2中的碱基排序不同,这样设计的好处是防止目的基因反向连接,防止线性化质粒或目的基因的自身环化,以保证目的基因能够正确连接并表达;引物是一段已知目的基因的脱氧核苷酸片段,故一般来说只需要改变图中的引物A和引物B,即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。(4)将目的基因导入微生物细胞时,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易吸收环境中DNA分子的感受态;对微生物进行计数的方法有用显微镜计数法和稀释涂布平板法(用于活菌计数);若计数结果分别是M、N,致死率可用(M-N)/M100%表示,在用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个

34、细胞连在一起时,在平板上观察到的是一个菌落,因此N偏小,进而导致此结果较真实值偏大。8.答案:(1)引物和引物定位目的基因的位置,与模板链结合,作为DNA聚合酶的作用起点(2)防止目的基因(LDH)和质粒的自身环化,有利于目的基因(LDH)在质粒上正向连接T4 DNA连接酶(3)氨苄青霉素质粒上含有真核生物的复制原点,能在酵母菌中复制(4)乳酸浓度过高导致pH下降,抑制酵母菌生长60解析:(1)由图可知,采用PCR技术扩增LDH需要的引物是引物和引物,原因是DNA聚合酶只能从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,而不能把单个的脱氧核苷酸连接在一起。该过程中引物的作用是定位目的基因的位置,与模板链结合,

35、作为DNA聚合酶的作用起点。(2)由图可知,质粒的启动子和终止子之间存在EcoR和Apa的酶切位点,将LDH基因插入质粒前,可用EcoR和Apa酶切质粒和LDH,为保证扩增出的LDH以正确的方向插入质粒,需要利用双酶切技术,双酶切的优点是可以防止目的基因和质粒的自身环化,有利于目的基因(LDH)和质粒的正向连接。将LDH连接在质粒上所用的酶是T4 DNA连接酶,因为EcoR酶切出的是黏性末端,而Apa酶切出的是平末端。(3)首先将基因表达载体导入大肠杆菌并进行筛选,由于质粒上含有氨苄青霉素抗性基因,筛选时培养基中应加入氨苄青霉素。再将含有的基因表达载体的大肠杆菌与酵母菌置于电转杯中,通过电激将目的基因表达载体导入酵母菌。质粒在酵母菌中不会随着酵母菌的增殖而丢失,原因是质粒上含有真核生物的复制原点,能在酵母菌中复制。(4)由图可知,在培养时间超过100 h后,乳酸浓度不再上升,其主要原因是乳酸浓度过高,导致pH下降,抑制酵母菌生长。为提高乳酸的生产效率,连续发酵时添加新培养基的最长周期应为60 h,因为在60 h之前,酵母菌产生乳酸的效率较高,60 h之后效率降低,100 h之后基本不再产生乳酸。