2024年高考生物一轮复习（新人教版） 第10单元　第6课时　基因工程的基本工具和基本操作程序.docx

1、第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序课标要求1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。考点一重组DNA技术的基本工具1基因工程的概念别名重组DNA技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平结果创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品2.基因工程的诞生和发展(1

2、)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。(3)中心法则的确立。(4)遗传密码的破译。(5)基因转移载体和限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。(6)DNA体外重组的实现。(7)重组DNA表达实验的成功。(8)DNA测序和合成技术的发明。(9)PCR技术的发明。(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。3重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)(2)DNA连接酶(3)载体(1)源于选择性必修3 P71“旁栏

3、思考”：原核生物中存在限制酶的意义是什么？提示原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？提示原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。延伸应用图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择Pst，而不

4、选择Sma。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Pst；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst和EcoR两种限制酶。构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制性内切核酸酶的识别序列和切点是，限制性内切核酸酶的识别序列和切点是，根据图示分析回答下列问题：(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶和限制性内切核酸酶切割后形

5、成黏性末端的过程。提示限制性内切核酸酶：限制性内切核酸酶：(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。提示用限制酶切割目的基因，用限制酶切割质粒。限制酶的识别序列包含限制酶的识别序列，因此限制酶也可切割限制酶的位点，故使用限制酶时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶切割质粒。1下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是()限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRCAATTCSau

6、3AGATCHindGTYRACSmaCCCGGG注：Y为C或T，R为A或G。AHind、Sma两种限制酶切割后形成平末端BSau3A限制酶的切割位点在识别序列的外部CBamH和Sau3A两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列答案D解析Hind、Sma两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3A限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamH限制酶识别GGATCC序列，Sau3A限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；Hind能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D错误。2质粒是基因工程中最

7、常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是()A质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子B在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点C携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择答案D解析质粒不只分布于原核生物中，在真核生物酵母菌细胞内也有分布；并不是所有的质粒上都有限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制。归纳提升与DNA有关的几种酶的比较考点二基因工程的基本操作程序1目的基因的筛选与获取(1)目的基因：

8、在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。(2)筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取人工合成目的基因。PCR获取和扩增目的基因aPCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。bPCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。cPCR扩增的过程dPCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。

9、通过构建基因文库来获取目的基因。(1)源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。(2)源于选择性必修3 P77“相关信息”：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作

10、用(3)构建过程提醒启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射法Ca2处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA中农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显

11、微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态基因表达载体导入辨析(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。4目的基因的检测与鉴定PCR是一项根据DNA半保留复制的

12、原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题：(1)什么是引物？提示引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(2)PCR技术为什么需要引物？提示DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链。(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？提示目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？提示两种引物之间不能互补配对。(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达

13、，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？提示经过n轮循环需要消耗引物数为(2n12)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。3(2023湖北宜昌高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮

14、PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是()APCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译B单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变C第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链D利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程答案C解析单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B正确；除了第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋

15、白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。4下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是()A过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与B过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性C抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达D转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定答案D解析题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，A错误；CaCl2处理只是提高农杆菌细胞细胞膜的通透性，B错误；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；转基因抗植物病

16、毒番茄是否培育成功可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染来进行鉴定，D正确。归纳提升(1)PCR技术和DNA复制的比较(2)PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数123nDNA分子数2482n含引物A(或B)的DNA分子数1372n1同时含引物A、B的DNA分子数0212222262322n2共消耗的引物数量22112622121423122n12考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定1DNA的粗提取与鉴定(1)基本原理(2)操作流程注意加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。2DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础P

17、CR原理：利用了DNA的热变性原理。电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。(2)PCR实验操作步骤(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。1在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？提示(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处

18、理。(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。(3)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。2如何来评价扩增的效果？提示观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。5(2023江苏苏州高三期末)下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是()A洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量B滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加C向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质D用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化答案D解析洋葱研磨液要用纱布过滤，A错误；DNA在

19、冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒精中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提纯DNA，但提取量不变，B错误；向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液有利于去除杂质，加入2 mol/L的NaCl溶液是溶解粗提取的DNA，C错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热，冷却后再观察颜色变化，D正确。6下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是()A选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞B图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显C图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质

20、能溶于酒精D图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色答案D解析图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2中蓝色变化不明显，B正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，D错误。1(2021湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是()A增加模板DNA的量 B延长热变性的时间C

21、延长延伸的时间 D提高复性的温度答案D解析增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带的产生，B、C错误。2(2019江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是()A用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近BDNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热答案A解析哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验

22、材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。3(2020北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是()A BC D答案B

23、解析引物扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物扩增的片段不含启动子，引物扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是，B正确。4.(2022江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：(1)纤毛结构如图所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由_组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是_

24、。(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是_。PCR扩增时，需在_催化下，在引物_端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将XGFP基因融合片段M导入如图所示载体质粒Y，构建YM重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。分步实验目标简易操作、结果、分析PCR鉴定正向重组质粒YM

25、(图中融合片段M中有白色的箭头，代表方向)选择图引物_；PCR目的产物约为_bp确保M及连接处序列正确，YM的连接处上游含有Hind EcoR V的识别序列，下游含有EcoR VBamH 的识别序列质粒测序，图中正确的是_(选填序列编号)检测融合蛋白定位对照质粒YGFP(仅表达GFP)与实验质粒YM分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明_(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，

26、而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_倍。答案(1)磷脂、蛋白质发出星射线，形成纺锤体(2)溶解DNA耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)3(3)a、b1 100Q3X蛋白参与中心体的形成(4)逆转录32解析(2)从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在TaqD

27、NA聚合酶的催化下，在引物的3端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(3)PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图中的引物a和引物b，PCR目的产物约为3008001 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，YM的连接处上游含有Hind EcoR V的识别序列，下游含有EcoR VBamH 的识别序列，根据题干信息构建YM重组质粒(在EcoRV位点插入片段)，YM的连接处测序后部分序列应含有Hind 和BamH 识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q3。对照质粒YGFP(仅表达GFP)与实验质粒YM分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光

28、，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。(4)研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)，说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x215y220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的2532(倍)。1判断关于基因工程的基本工具的叙述(1)限制酶

29、只能用于切割目的基因()(2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶()(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因()2判断关于基因工程的基本操作程序的叙述(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因()(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制()(3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点()(4)PCR反应中温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应()3判断关于DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述(1)进行D

30、NA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 条件下储存()(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关()(3)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换()(4)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，遇甲紫会呈现红色()4填空默写(1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(2)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(3)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子

31、的筛选。(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。(6)(选择性必修3 P81)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。课时精练一、选择题1(2023江苏宿迁高三质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是()A甲、乙、丙都属于黏性末端B甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能CDNA连接酶的作用位点在图乙中b处D切割甲的

32、限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子答案C解析甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，即图乙中a处，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为GAATTCCTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTGCTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。2T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过

33、共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是()AT4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性BT4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变CATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键DT4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下答案C解析T4 DNA连接酶有专一性，A错误；酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干信息“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连”可推测，ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；T

34、4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。3(2023安徽亳州高三检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶Bgl、EcoR和Sau3A的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是()A构建重组DNA时，可用Bgl和Sau3A切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体B构建重组DNA时，可用EcoR和Sau3A切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体C图乙中的P1噬菌体载体只用EcoR切割后，含有两个游离的磷酸基团D用EcoR切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA答案D解析P1噬菌体载体为环状DNA，其

35、上只含有一个EcoR的酶切位点，因此用EcoR切割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；由图甲可知，用EcoR切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。4下列有关获取目的基因的叙述，错误的是()A目的基因就是编码蛋白质的基因B筛选和获取目的基因是基因工程的第一步C来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因D序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会答案A解析目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第

36、一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。5(2023河北石家庄高三模拟)如图是快速RTPCR过程示意图，和为逆转录酶催化的逆转录过程，是PCR过程。据图分析，下列叙述错误的是()A逆转录酶具有DNA聚合酶的能力BPCR过程只需要引物bCRTPCR可检测基因表达水平DRTPCR可检测新冠病毒等RNA病毒答案B解析PCR过程需要引物a、b，因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的，也有与cDNA一致的

37、，B错误。6(2022山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是()A过滤液沉淀过程在4 冰箱中进行是为了防止DNA降解B离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D粗提取的DNA中可能含有蛋白质答案B解析离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。7(2023江苏泰州高三调研)引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是()A引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高B根据需

38、要可在引物的5端添加限制酶识别序列、点突变序列等C两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合D引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增答案B解析退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；根据需要可在引物的5端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，B正确；两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC

39、含量过高，氢键越多，不利于退火，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。8DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是()ADNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢B凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测C拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率D新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染答案C解析拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再体积分数为用95%的冷酒

40、精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率，C错误。9(2023江苏扬州高三质检)实时荧光RTPCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RTPCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法不正确的是()A做RTPCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针BRNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D病毒的检测还可以检测病毒表

41、面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原抗体杂交答案C解析PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。10(2023江西南昌高三模拟)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是()注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因；TetR：四环素抗性基因。A应选择的限制酶组合是酶F和酶GB所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因C用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌D

42、同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带答案C解析为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌进行选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据题图分析可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。11(2023江苏南京师大附中高三调研)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要

43、有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是()A重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体B载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因C必须把目的基因插入重组载体A的启动子和终止子之间D培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异答案C解析培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D正确。二、非选择题12如图pIJ702是

44、一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶Sac、Sph、Bgl在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：项目pIJ702pZHZ8Bgl5.7 kb6.7 kb表1固体培养基中硫链丝菌素浓度(g/mL)012510不含质粒的链霉菌生长状况注：“”表示生长；“”表示不生长。表2(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断裂，切割形成的末端有_两种。(2)以Sac和Sph切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的Sac/Sph片段进行置

45、换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶Bgl酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为_kb，判定目的基因中含有一个Bgl切割位点的理由是_。(3)导入目的基因时，首先用Ca2处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成_过程。(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在_g/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是_。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥

46、功能作用，第一步需检测受体细胞的_(填“DNA”或“RNA”)。答案(1)磷酸二酯键黏性末端和平末端(2)1.4pIJ702上的原有Bgl切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被Bgl切割成一条线段(3)转化(4)5根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选RNA解析(2)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.75.70.41.4(kb)。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌

47、素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 g/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5 g/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成mRNA。13(2021江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：(1)目的基因的扩增提取真菌细胞_，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致_。热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到8

48、0 以上再混入酶，然后直接从94 开始PCR扩增。下列叙述正确的有_。ATaqDNA聚合酶最适催化温度范围为5060 B与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物C两条子链的合成一定都是从5端向3端延伸DPCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性(2)重组质粒的构建将Sma切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进_，形成Am结合体。将Am结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及_酶等，完成质粒的环化。若正确构建的重组质粒Am仍能被Sma切开，则Sma的酶切位点可能在_。(3)融合蛋白的表达用含有尿嘧

49、啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒Am，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是_。若通过抗原抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明_，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。答案(1)RNA蛋白M上不含tag标签BC(2)黏性末端碱基互补配对DNA连接基因m的连接处、基因m的内部(3)受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因，可以长成菌落融合基因表达(或重组质粒Am构建成功)解析(1)以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因

50、下游，若基因m的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。从题干信息可知，“80 以上再混入酶，然后直接从94 开始PCR扩增”，故TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为94 左右，A错误；PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到70 之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；DNA分子复制具有方向性，都是从5端向3端延伸，C正确

51、；TaqDNA聚合酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高温，D错误。故选BC。(2)从图上看，载体A只有一个Sma的酶切位点，故被Sma切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将Am结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。重组质粒中，载体A被Sma切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒Am仍能被Sma切开，则Sma的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。(3)

52、筛选目的菌株的机理：导入了质粒Am的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。若通过抗原抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或重组质粒Am构建成功)。14如图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶Pst、EcoR和Hind 的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有_的因子。过程所用到的组织细胞是

53、_，过程的目的是_，过程常用_处理大肠杆菌。(2)如果用限制酶Pst、EcoR和Hind对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有_种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有_种和_种。(3)如果只用限制酶Pst切割目的基因和质粒，完成过程、后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选_的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体

54、内导入的是_。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_。答案(1)调控作用人垂体组织细胞将平末端处理为黏性末端Ca2(2)933(3)含四环素抗性基因完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒)在丙中能存活，在乙中不能存活解析(2)假设Pst、EcoR和Hind三种酶的切点分别用1、2、3表示(后面的均按照顺时针方向)。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段11、22、33；任意两种酶分别同时酶切时，可得到12、21、23、32、13、31六种片段；三种酶同时酶切时，可得到12、23、31三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(11、12、13、21、22、23、31、32、33)。其中片段32、22、33共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段21、22、11共3种含有完整四环素抗性基因。