2024年高考生物一轮复习（新人教版） 第10单元　解惑练4　PCR技术拓展应用.docx

1、解惑练4PCR技术拓展应用应用1：反向PCR测定未知DNA区域当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。应用2：PCR定点突变技术该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后

2、，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。应用3：(实时)荧光定量PCR(RTPCR)先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信

3、号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。跟踪训练1如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的TDNA，要想对TDNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是()A用引物和引物直接进行PCR扩增之后再测序B用引物和引物直接进行PCR扩增之后再测序C用DNA连接酶连接成环状后，再用引物PCR扩增后测序D用DN

4、A连接酶连接成环状后，再用引物PCR扩增后测序答案C解析直接选用引物、组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物和引物可实现对已知的TDNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物PCR扩增后测序，恰好可扩增出TDNA两侧的未知序列，C正确。2重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是()A过程需要含Mg2的缓冲液、DNA模板、引物、4种

5、脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等B若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子C经过程获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程获得目的基因D过程使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物答案B解析过程为PCR反应，需要在添加了Mg2的缓冲液中才能进行，需要提供模板DNA、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；过

6、程获得的杂交DNA有2种，一种3端为单链，一种5端为单链，5端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。3(2023北京顺义区高三检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入_；图甲所示的基因定点突变技术需要_次PCR；获得产物A需要的引物是_。(2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯

7、化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为_，基因M1的长度为_。项目基因MAB长度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05(3)通过图甲过程获得的基因M1仍需要大量扩增，此时选择的引物是_，为了与图乙中的Ti质粒相连，还需要分别在它们的_端引入限制酶_的识别序列。(4)构建基因表达载体时，M1基因必需插入到Ti质粒的_中，原因是_。答案(1)Taq DNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2)等3引物1和引物3(2)0.23 kb6.09 kb(3)引物1和引物25Hind、Pst(顺序应与前

8、面的引物对应)(4)TDNATi质粒上的TDNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上解析(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入TaqDNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2)等。从图甲可以看到，从加入引物到获得基因M1总共经历了3次PCR。产物A的两端互补的引物是引物1和3。(2)基因M上有3个酶切位点(箭头处)，完全酶切产生4个片段，分别为3.24 kb、2.8 kb、0.15 kb、0.13 kb，共6.32 kb，A片段酶切后产生2个片段，分别为2.8 kb、0.09 kb，B片段酶切后产生2个片段，分别为3.24 kb、0.05 kb，图中A片段

9、和B片段的“”是相同的，因此“”处为0.05 kb，则基因M1的长度为2.80.053.246.09(kb)，因此基因敲除片段的长度为6.326.090.23 (kb)。(3)获得基因M1后，与M1两条链两端互补的引物是引物1和引物2。由于质粒上有三个酶切位点，切割后会出现不同的黏性末端，而基因M1两端没有能与黏性末端互补的序列，故需要分别在基因两条链的5端引入限制酶的识别序列，根据基因M1插入质粒的位置可知，添加的是限制酶Hind、Pst的识别序列。4(2023河北唐山一中高三模拟)“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在12 h内即可得到检测结果。Taqman探针是实时荧光

10、定量RTPCR技术中的一种常用探针(如图1)，其5端连接荧光基团(R)，3端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题：(1)结合图1和图2分析，“荧光RTPCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有_酶、_酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RTPCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的_、_有关。(2)根据Taqman探针功能分析

11、，探针中碱基序列的设计应主要依据_。新冠病毒是冠状病毒大家庭中新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计Taqman探针时应筛选出该病毒特有的序列，以避免_(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。(3)根据图1和图2，Taq DNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能_。(4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与_、_有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧

12、光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如图3)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中_等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。(5)虽然荧光RTPCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有_(填字母)。a通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足b在样本运输、检测中出现了损坏和污染c病毒相应关键序列发生了基因突变答案(1)逆转录TaqDNA聚合引物Taqman探针(2)新冠病毒RNA内部的一段序列(或新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列)假阳性(3)催化RNA(Taqman探针)的水解(

13、4)扩增次数样品中病毒初始数量(或病毒样品模板RNA含量)原料、引物和探针数量(或Taq DNA聚合酶活性)(5)abc解析(1)图1和图2所示新冠检测的基本原理：将新冠病毒RNA逆转录为cDNA，因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有逆(反)转录酶、耐高温的DNA聚合酶、Taqman探针、引物、dNTP、Mg2、缓冲剂等。试剂盒中的引物和Taqman探针决定了这种分子层面的荧光RTPCR检测具有特异性和高灵敏性。(3)根据图1和图2可知，TaqDNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能催化RNA(Taqman探针)的水解，Taqman探针水解释放出游离R被仪器检测到。(4)在PCR扩

14、增过程中，TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R，因此，扩增次数越多，样品中病毒初始数量(病毒样品模板RNA含量)越多，则被水解的探针越多，释放出游离的R越多，反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)也越强。由图3可知，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加，其原因最可能是试剂盒中原料、引物和探针数量(TaqDNA聚合酶活性)等有限。(5)荧光RTPCR出现“假阴性”可能是通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足，使荧光信号强度(Rn)未达到或超过阈值而没有检测出；也可能是在样本运输、检测中出现了损坏和污染，导致新冠病毒核酸破坏而无法检测；还可能是病毒相应关键序列发生了基因突变，导致探针失效而无法检测，因此a、b、c正确。