2013-2014学年高二生物课件：6.2 DNA片段的扩增——PCR技术（中图版选修1）.ppt

1、课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测 第二节 DNA片段的扩增PCR技术课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测课程标准尝试PCR技术的基本操作和应用。课标解读1简述PCR技术的原理和用途。2简述PCR技术的基本操作步骤。3进行DNA片段的PCR扩增。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)解旋在_的作用下解开DNA双链。(2)合成引物在_的作用下，以_为模板，合成一段RNA引物。PCR的原理和过程1DNA的复制解旋酶RNA聚合酶DNA单链课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(3)合成子链以_为起点，在_的作用下，以_为原料，按照_原则合成两条新的DNA子链。(1)PCR的定义DNA体外扩增技术

2、实际上是在体外模拟_过程，形成大量_，这个反应过程称为_，简称PCR。(2)PCR与DNA复制的不同点2PCR技术RNA引物DNA聚合酶四种脱碱基互补配对细胞内的DNA复特异性的DNA片段聚合酶链式反应氧核苷酸制课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测PCRDNA复制引物人工合成的_或RNA，其长度通常为_RNA解旋通过对_来实现的解旋酶(1)准备：将PCR缓冲液、_、_、四种脱氧核苷酸、_、Mg2等成分加到一个特制的离心管中；(2)高温变性：把离心管置于_的环境中，使DNA碱基对之间的_断裂，形成_单链，这个过程称为高温变性；DNA单链2030个脱氧核苷酸反应温度的控制3.PCR的过程DNA模板

3、一对引物DNA聚合酶95氢键两条课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(3)低温复性：再将离心管置于_的环境中，使_分别结合到两条分开的模板链上，这个过程称为低温复性；(4)中温延伸：最后将离心管置于_ 的环境中，在_的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个一个地连接上去，形成两条新的_，这个过程称为中温延伸。在12 h内重复_次循环，DNA片段数可增至_倍。4PCR的结果55 一对引72DNA子链2530106物聚合酶107课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测为什么DNA复制必须有引物？提示DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能以3延伸DNA链，故DNA合成时，必须加入引物(其3游离)以作为

4、延长DNA子链的“引子”。思维激活1课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)PCR原理PCR原理：DNA分子在一定条件下可以进行半保留复制。DNA的热变性原理：在80100 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。1PCR的原理课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(2)PCR扩增方向3端和5端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而含磷酸基团的末端称为5端；一个双链DNA分子中含两个3端和两个5端，如果一条链的方向是35，则另一条链的方向就是53，这就是反向

5、平行的含义。DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过3，5磷酸二酯键相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子上的羟基(OH)，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成。所以DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)PCR的反应条件稳定的缓冲液环境；DNA模板；分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物；四种游离的脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶；能严格控制温度变化的温控设备。(2)PCR过程高温变性当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链。2PCR的过程课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测低温

6、复性温度下降到55 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，形成局部双链。中温延伸温度上升到72 左右，在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的5端3端延伸合成与模板互补的DNA链。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性、中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增。(2)PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间

7、固定长度的序列数目为230。3PCR的结果课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测下列有关PCR技术的叙述不正确的是 ()。A聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增DNA片段的技术B在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内 DNA的复制类似CPCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸DPCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性、延伸【巩固1】课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测解析PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板(母链)、酶、原料、能量等条件。P

8、CR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步。答案C课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测先用_在_中依次加入各组分：_ _、耐高温的_、脱氧核苷酸贮备液、_、_。第一次循环：_预变性5 min _ 复性1 min _ 延伸1 min；重复30次：_ 变性30 s _ 复性30 s _ 延伸1 min；最后一次循环：_ 延伸7 min，反应产物在_ 保存。PCR技术的实验操作1PCR扩增前的准备2PCR扩增循环微量取样器微量离心管模板DNA聚合酶PCR缓冲液引物DNA955572955572724课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测 PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要解旋酶

9、吗？提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但该解旋过程不是解旋酶催化的结果，而是利用DNA热变性的原理，在80100 温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。思维激活2课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测1PCR扩增前的准备移液用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分：模板DNA、耐高温DNA聚合酶、脱氧核苷酸贮备液、PCR缓冲液、引物混合盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀离心将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是使反应液集中在离心管底部反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测PCR仪自动化程度

10、较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸保存第1次95，5 min55，1 min72，1 min重复30次95，30 s 55，30 s 72，1 min最后一次 72，7 min4 2PCR热循环程序的设置课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替。三个恒温水浴锅的温度分别为94、55 和72，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(1)检测PCR扩增效果的原因3检测PCR扩增效果课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2n，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对D

11、NA含量进行测定。(2)原理DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关，可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(3)检测过程10倍稀释：10 L PCR反应液，加入90 L蒸馏水，即将样品进行10倍稀释。对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。测定：取DNA稀释液加入到厚度为1 cm的比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测有关下列操作过程的叙述，错误的是 ()。APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高

12、压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换【巩固2】课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测解析 为了防止外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性枪头，即A、B、D正确。在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C错误。答案C课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测美国科学家穆里斯发明了PCR技术。PCR技术是一种DNA分

13、子“复印机”，它可以在数小时内将一个DNA分子复制出1千亿个，解决了检测样本扩增的难题。在人类基因组计划实施中，RCR技术使每个核苷酸的识别成本降低至510美元。穆里斯因发明PCR技术而荣获了诺贝尔奖。(1)DNA复制时需要大量的_作原料，在DNA聚合酶的催化下以解旋后的单链为_进行生物合成。【例1】示例一 PCR的原理课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(2)在DNA分子解旋时必须加热，普通的酶容易_，莫里斯从温泉中找到了耐95 高温的_，解决了酶重复使用的难题，使链式反应成为可能。每次循环可分为_、_、_三步。思维导图：课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测深度剖析DNA复制的模板是DNA分

14、子的每一条链，并以脱氧核苷酸为原料，在DNA聚合酶的作用下进行复制。由于在体外打开双螺旋结构，需要加热处理，因此，选用的DNA聚合酶必须能耐高温。答案(1)脱氧核苷酸 模板(2)变性(失活)Taq DNA聚合酶 高温变性 低温复性 中温延伸课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测方法技巧 PCR技术特点：PCR不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；PCR需要耐热的DNA聚合酶即TaqDNA聚合酶，而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性；PCR一般需经三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的控制。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测使用PCR仪具体实验操作顺序应为 ()。设计好PC

15、R仪的循环程序 按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部ABCD思维导图：【例2】示例二PCR技术实验操作课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测深度剖析PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。答案C课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测方法技巧 PCR技术操作注意事项为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，

16、移液器上的枪头必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测科学猜想、推测与科学实验是进行科学发现的孪生兄弟，二者往往密不可分，DNA复制方式的发现就是如此。探究DNA复制的方式技法必备课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测DNA分子双螺旋结构模型提出之后，人们又去探究DNA是如何传递遗传信息的。当时推测可

17、能有如图A所示的三种方式。1958年，Meslson和Stah 1用密度梯度离心的方法，追踪由15N标记的DNA亲本链的去向，实验过程是：在氮源为14N的培养基上生长的大肠杆菌，其DNA分子均为14NDNA(对照)，在氮源为15NDNA的培养基上生长的大肠杆菌，其DNA均为15NDNA(亲代)，将亲代大肠杆菌转移到含14N的培养基上，再连续繁殖两代(子代和子代)后离心得到如图B所示的结果。能力展示课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测图A课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测图B课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测请依据上述材料回答下面的问题。(1)如果与对照相比，子代离心后能分辨出轻和重两条密度

18、带，则说明DNA传递遗传信息的方式是_。如果子代离心后只有1条中等密度带，则可以排除DNA传递遗传信息的方式是_。如果子代离心后只有1条中等密度带，再继续做子代的DNA密度鉴定：若子代离心后能分出中、轻两条密度带，则可以确定DNA传递遗传信息的方式是_。若子代离心后不能分出中、轻两条密度带，则可以确定DNA传递遗传信息的方式有_的可能。(2)他们观测的实验数据如下：课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测梯度离心DNA浮力密度(g/mL)表：世 代实验对 照亲代1.7241.710子代1.7171.710子代(1/2)1.717，(1/2)1.7101.710子代(1/4)1.717，(3/4)1

19、.7101.710分析实验数据可知：实验结果与当初推测的DNA三种可能复制方式中的_方式相吻合。答案(1)全保留复制 全保留复制 半保留复制 分散复制(2)半保留复制课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是 ()。A95、55、72 B72、55、95 C55、95、72 D80、55、72 1.课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测解析 当温度上升到90(9096)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50(4060)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72(7075)时，溶液中的

20、四种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA，称为延伸。答案A课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测(长春模拟)下列关于PCR的描述中，正确的是 ()。PCR是一种酶促反应引物决定了扩增的特异性扩增DNA利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列ABCD解析PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。答案D2课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测右图是PCR技术示意图，请回答下列问题。(1)标准的PCR过程一般分为_、_、_三大步骤。(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段_。(3)将双链DNA_，使之变性，从而导致_。(4)引物延伸需提供_作为原料。3课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测解析(1)PCR过程一般分高温变性低温复性中温延伸三大步骤。(2)引物的化学本质为一小段单链DNA或RNA。(3)将DNA加热至90 以上，可导致DNA解旋。(4)引物延伸需提供脱氧核苷酸作为原料以形成DNA单链。答案(1)高温变性 低温复性 中温延伸(2)单链DNA或RNA(3)加热到94 双链DNA解旋成两条单链(4)四种脱氧核苷酸课堂互动探究热点考向示例随堂达标检测课堂小结