专题20 基因工程-学易金卷：2023年高考生物一模试题分项汇编.docx

1、专题20 基因工程(2023届安徽省合肥市高三第一次教学质量检测)20. 某质粒上有SalI、Hind、BamH三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，获得此质粒的农杆菌表现出对两种抗生素的抗性。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请据图分析，下列表述错误的是（ ）A. 在构建重组质粒时，选用Hind和SalI两种酶切割目的基因的两端及质粒可防止目的基因和质粒的自我环化B. 用分别含有氨苄青霉素和四环素的培养基筛选农杆菌时，发现含有目的基因的农杆菌不能在含四环素的培养基上生长，说明抗四环素基因未起到标记基因的作用C. 采用农杆菌转化法是因为农杆菌感染烟草细胞时

2、，其内的重组Ti质粒上的T-DNA能将目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上D. 利用植物组织培养技术培育转基因抗盐烟草植株，依据的原理是高度分化的植物细胞具有发育成完整植株的能力【答案】B【解析】【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基

3、因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【详解】A、在构建重组质粒时，选用Hind和SalI两种不同的限制酶切割目的基因的两端及质粒可防止目的基因和质粒的自我环化，A正确；B、所给的限制酶在质粒上的切割位点都位于抗四环素基因的部位，如果目的基因插入到质粒中，得到重组质粒，则含重组质粒的农杆菌只含有完整的抗氨苄青霉素基因，不含完整的抗四环素基

4、因（被目的基因破坏），则含有目的基因的农杆菌不能在含四环素的培养基上生长，这能说明抗四环素基因起到了标记基因的作用，B错误；C、农杆菌中的T-DNA 可转移至烟草细胞，并整合到烟草细胞染色体的DNA上，因此将目的基因导入植物细胞采用农杆菌转化法，C正确；D、植物组织培养技术依据的原理是植物细胞的全能性，D正确。故选B。(2023届安徽省淮北市高三一模)25. 针对奥密克戎变异株的第四针剂新冠疫苗“威克欣”，是将新冠病毒基因引入昆虫细胞，制备新冠病毒S蛋白。该疫苗注入人体后诱导产生抗体，目前该产品已实现大规模生产。回答以下问题：（1）新冠病毒基因经过逆转录后形成的 DNA，常采用_技术扩增。（2

5、）基因工程的核心步骤是_；该过程需要在目的基因上游和下游分别添加特定的_和终止子，以便使目的基因可以正常_。（3）若用病毒作为运载体将新冠病毒基因导入昆虫细胞和大肠杆菌，所用的病毒_（填“相同”或“不相同”）。若要通过培养大肠杆菌生产该疫苗，则需要分离和提纯大肠杆菌，通常情况下，我们需要对培养基进行_灭菌，当采用平板划线法分离大肠杆菌时，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，目的是_。【答案】（1）PCR （2） . 基因表达载体的构建 . 启动子 . 转录（表达） （3） . 不相同 . 湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） . 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端

6、开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落【解析】【分析】基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定；分离纯化菌种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。【小问1详解】新冠病毒基因（RNA）在逆转录酶的作用下，经过逆转录后形成的DNA，常采用PCR技术对其进行扩增。【小问2详解】基因工程的基本操作程序主要包括4个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，其中核心步骤是基因表达载体的构建；该过程需要在目的基因上游和下游分别添加特定的启动

7、子（它是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录）和终止子（使转录停止），以便使目的基因可以正常转录（表达）。【小问3详解】若用病毒作为运载体将新冠病毒基因导入昆虫细胞和大肠杆菌，因导入的受体细胞不同，所用的病毒不相同；若要通过培养大肠杆菌生产该疫苗，则需要分离和提纯大肠杆菌，通常情况下，需要对培养基采用湿热灭菌或高压蒸汽灭菌；当采用平板划线法分离大肠杆菌时，为保证能得到由单个细菌繁殖而来的菌落，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，目的是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少。(2023届安徽省黄山市高三

8、一模理综)11. 新冠病毒是RNA病毒，病毒的S蛋白（刺突蛋白）是决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白，可与宿主细胞的受体结合。下面为两种针对新冠病毒的疫苗研发方法，回答下列问题。方法技术路线基因工程疫苗S蛋白基因基因表达载体大肠杆菌S蛋白人体腺病毒载体重组疫苗S蛋白基因腺病毒基因表达载体人体（1）基因表达载体的组成除了S蛋白基因外还必须有标记基因、启动子、_（答出2点）等。基因表达载体的构建有利于目的基因完成转化，转化是指_。（2）基因工程疫苗制备过程中需要分离和提纯大肠杆菌，通常情况下，我们需要对培养基进行_灭菌，当采用平板划线法分离大肠杆菌时，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，其目

9、的是_。（3）除研制疫苗外，还可对新冠病毒进行免疫学检测以阻断传播途径，其过程是：向小鼠体内注射新冠病毒S蛋白后分离产生的B淋巴细胞，并与小鼠的骨髓瘤细胞融合，常用的融合方法有_（答出1种）；再多次筛选、检测，最终获得所需杂交瘤细胞，该种细胞的特点是_。获得的杂交瘤细胞可在体外条件下做大规模培养，或注射到_内增殖，获得大量可与S蛋白特异性结合的单克隆抗体作为诊断试剂。【答案】（1） . 终止子、复制原点 . 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 （2） . 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） . 使微生物的数目随着划线次数的增加而减少（保证接种环上的细菌来自上一次划线的末端） （

10、3） . PEG融合法（灭活病毒诱导融合） . 既能迅速大量繁殖，又能产生与S蛋白特异性结合的专一抗体 . 小鼠腹腔【解析】【分析】单克隆抗体的制备：（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞。（2）获得杂交瘤细胞：将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。（3）克隆化培养和抗体检测。（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取。【小问1详解】基因表达载体包括复制原点、启动子、终止子、标记基因、目的基

11、因等。基因表达载体的构建有利于目的基因完成转化，转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。【小问2详解】为防止杂菌污染，对培养基往往要进行高压蒸汽灭菌；采用平板划线法分离大肠杆菌时，第二次及以后的划线都要从上一次划线的末端开始，其目的是使微生物的数目随着划线次数的增加而减少（保证接种环上的细菌来自上一次划线的末端）。【小问3详解】诱导动物细胞融合的方法有电融合法、聚乙二醇、灭活病毒等诱导；经过多次筛选、检测，最终获得的所需杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生与S蛋白特异性结合的专一抗体。杂交瘤细胞可在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。(2023届福建省

12、泉州市高三质量检测（二）)20. 可用作生物表面活性剂的鼠李糖脂不仅具有优异的功能稳定性，还具有无毒、无污染、可被生物降解等优点，因而在医药、食品、农业、石油开采、环境污染修复等领域展示了其独特的应用前景。可合成鼠李糖脂的天然菌株存在致病性等缺点，而异源菌株中往往存在合成鼠李糖脂的重要前体物质，理论上只要将外源基因插入该菌株进行异源表达即可合成鼠李糖脂。某科研团队选择在无致病的异源菌株恶臭假单胞菌（P.putida）中插入外源基因rhIA以合成鼠李糖脂。已知表达载体pBBRmcs-5的MCS含有多种限制性核酸内切醇的单一切点，GmR为庆大霉素的抗性基因。请回答：（1）利用PCR技术获取外源基因

13、rhIA：以下可提供外源基因rhIA模板的菌株有_。Pputida Ecoli Paeruginosa Burkholderia sp（2）因外源基因rhIA不含有MCS中的限制酶酶切位点，需对上述PCR产物进行二次PCR扩增。二次PCR所使用的引物应该在第一次PCR引物的_（填“3”或“5”）端插入包含限制酶酶切位点的序列。在上游引物所插入的序列含有5AGGGCGAATTGGAGCTC3，下游引物插入的序列含有5GCTTGATATCGAATTCGA3。（3）基因表达载体构建：将表达载体pBBRmcs-5与上述扩增产物用SacI和_限制性核酸内切酶酶切后进行连接。（4）将目的基因导入受体细胞：

14、用_处理Pputida使其处于能够吸收外源DNA的生理状态，与上述基因农达载体混合培养一段时间。（5）目的基因的检测与鉴定：用稀释涂布法将培养液接种到含庆大霉素的_（填“选择”或“鉴别”）培养基上培养以检测表达载体是否导入重组菌株。通过PCR技术可检测_。a、表达载体pBBRmcs-5是否含有外源基因rhIAb、外源基因rhIA是否转录出mRNAc、外源基因rhIA是否表达出相应的蛋白质测定发酵液中_的含量。【答案】（1） （2）5 （3）EcoR （4）Ca2+（或CaCl） （5） . 选择 . ）ab . 鼠李糖脂【解析】【分析】基因工程的基本操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构

15、建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、 DNA 连接酶、运载体。【小问1详解】由题意可知，可合成鼠李糖脂的天然菌株存在致病性等缺点，而异源菌株中往往存在合成鼠李糖脂的重要前体物质，理论上只要将外源基因插入该菌株进行异源表达即可合成鼠李糖脂，故外源基因rhIA应存在于天然菌株中，可提供外源基因rhIA模板的菌株有Paeruginosa 和Burkholderia sp.两种天然菌株。小问2详解】DNA聚合酶的连接方向为35，故二次PCR所使用的引物应该在第一次PCR引物的5端插入包含限制酶酶切位点的序列。【小问3详解】由图可知四中

16、限制酶的识别序列，已知目的基因上游引物所插入的序列含有5AGGGCGAATTGGAGCTC3，下游引物插入的序列含有5GCTTGATATCGAATTCGA3，SacI可以特异性识别并切割位于上游引物的GAGCTC序列，下游引物中含有的GAATTC序列可以被EcoR识别并切割，故将表达载体pBBRmcs-5与上述扩增产物用SacI和EcoR限制性核酸内切酶酶切后进行连接。【小问4详解】用Ca2+（或CaCl）处理菌株，会使菌株形成能够吸收外源DNA的生理状态，可以将重组的基因表达载体导入其中。【小问5详解】重组的基因表达载体含有庆大霉素的抗性基因，用稀释涂布法将培养液接种到含庆大霉素的选择培养基

17、上，只有含有表达载体的菌株可以正常生长，以检测表达载体是否导入重组菌株。可以直接利用PCR技术检测表达载体pBBRmcs-5是否含有外源基因rhIA或外源基因rhIA是否转录出mRNA，其原理为碱基互补配对原则，故选ab。外源基因的插入使该菌株进行异源表达即可合成鼠李糖脂，若菌株成功导入外源基因rhIA，故测定发酵液中可以检测到鼠李糖脂。(2023届福建省漳州市高三第二次质量检测)19. 面对全球暴发的新型冠状病毒肺炎疫情，中国政府付出了巨大的努力。科研人员在新冠病毒的免疫应答机制、快速检测、免疫治疗、预防等方面做了大量的工作，取得了显著的成效，请回答下列问题：（1）当新冠病毒侵入内环境和感染

18、宿主细胞时，会激发人体的_免疫过程。（2）我国对新冠肺炎疫情的快速控制，与对新冠病毒的快速检测能力分不开。除核酸检测外，还可采用_(写出2种)检测方法，其中核酸检测采用的是实时荧光定量PCR技术，即在PCR反应体系中加入引物的同时加入荧光探针，探针完整时不发荧光。与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被荧光监测系统检测(图甲)，结果如图乙。新冠病毒为RNA病毒，PCR反应体系中除应加入Taq DNA聚合酶外，还应加入_酶。疾控中心检测5位新冠病毒感染者(图乙)，载毒量最高的是_，依据是_。若出现阴性结果也不能排除新型冠状病毒感集，可能产生似阴性的因素有_。

19、A 样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值B.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解C.病毒发生变异（3）目前，新冠病毒灭活疫苗全程接种需要接种多次，首剂次与第2剂次的接种间隔要在3周及以上，第2剂在首剂接种后8周内尽早完成。二次接种同种疫苗的目的是_，形成较好的免疫效果。（4）我国科学工作者研发的重组腺病毒疫苗已获批上审，腺病毒是常见病毒，人类感染腺病毒后仅产生轻微的自限性症状(疾病不会无限扩大，在人体免疫系统正常运作下，会逐渐改善)，且不整合进入染色体。与其他重组DNA疫苗相比，可减少多种临床风险，请说明理由_。【答案】（1）特异性(或体液免疫和细胞) （2） . 抗原检测和抗体 .

20、逆转录 . a . 达到荧光阈值所用循环数最小即Ct最小 . ABC （3）第一次接种产生的记忆细胞再次接触相同抗原时，迅速增殖分化，分化后产生更多的抗体 （4）减少载体对身体的伤害，腺病毒载体无插入突变风险，减少癌变和正常基因突变的概率。【解析】【分析】PCR技术的原理为DNA双链复制，所需条件有：引物、酶、模板DNA、4种脱氧核苷酸等。根据题意中，实时荧光定量PCR技术原理可知，荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。【小问1详解】当新冠病毒侵入内环境和感染宿主细胞时，人体会产生特异性免疫。【小问2详解】当前，新冠病

21、毒的检测方法有核酸检测、抗原检测和抗体检测；由于新冠病毒为RNA病毒，因此进行PCR前，需进行逆转录获得cDNA，因此还需加入逆转录酶；由图乙检测结果可知，a的荧光强度达到Ct阈值所用循环数是最少的，可推测a的载毒量是最高的；结合实时荧光定量PCR技术的检测原理，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值，样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，病毒发生变异等因素均有可能产生假阴性。【小问3详解】二次接种同种疫苗的目的是利用第一次接种引发机体特异性免疫产生的记忆细胞再次接触到相同抗原时，迅速增殖分化，产生大量的抗体，加强免疫效果。【小问4详解】重组腺病毒疫苗与其他重组DNA疫苗相比，可减少载体

22、对身体的伤害，腺病毒载体无插入突变风险，减少癌变和正常基因突变的概率。【点睛】本题结合图形，主要考查PCR技术的相关知识，识记PCR技术的原理和条件，能从图中提取新病毒检测过程中的关系信息，并综合分析、准确答题。(2023届福建省漳州市高三第二次质量检测)21. 油菜素内酯(BR)是一种天然的植物激素，在植物根的发育、叶片的形态建成、种子的发育和成熟等生理过程中发挥重要的调控作用。BR被膜受体BRI1识别后实现信号的传导。为研究玉米的BR受体基因(ZmBRI1基因)的功能，研究人员克隆玉米的ZmBRI1基因，并转化到野生型(Ws)和BR不敏感突变体(bril5)的拟南芥开展相关研究，回答下列问

23、题：（1）ZmBRI1基因克隆和表达载体构建，以某玉米的RNA为模板扩增ZmBRI1基因cDNA，采用酶切重组技术，将测序正确的目的基因构建到带有C启动子(该启动于具有高转录活性)的Ti质粒上。该步骤需要有限制酶、DNA连接酶和_酶、_酶。Ti质粒选取C启动子，目的是_（2）拟南芥转化及获得纯合转基因植株：采用_法将ZmBRI1基因转入Ws和bril-5中。鉴定成功转入ZmBRI1基因植株的方法是_。选取成功转化的植株，自交选育得到纯合的Ws转基因植株(OE1)和bril-5转基因植物(ZmBRI1-4)。（3）脱落酸(ABA)可抑制种子萌发，研究ZmBRI1转基因拟南芥的表型及ABA对ZmB

24、RI1转基因拟南芥种子萌发率等的影响时，得到如图结果：ZmBRI1基因可以修复bril-5的表型，理由是_。根据上述研究，ZmBRI1基因的功能包括_。【答案】（1） . 逆转录酶 . 热稳定DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶) . 使基因在转基因植株细胞中高效表达 （2） . 农杆菌转化 . PCR技术 （3） . ZmBRI1-4的株高和叶柄长度明显高于bril-5，与Ws基本无差别 . 表达BR受体，修复了BR的信号通路：降低了拟南芥对ABA的敏感性【解析】【分析】根据题图分析ZmBRII基因的功能，首先需要认识到ZmBRI1基因表达BR受体。又根据第(3)小问的图可知，ZmBRI1基因

25、的功能包括ZmBRII基因表达BR受体，修复了BR信号通路，修复了突变体的表型，ZmBRIl基因降低了拟南芥对ABA的敏感性。农杆菌转化的步骤如下：1、获得目的基因：用限制性内切酶切割目的基因；2、基因表达载体的构建：目的基因与载体(多为质粒)通过DNA连接酶连接；3、将目的基因导入受体细胞：将含有目的基因的重组质粒导入农杆菌；4、目的基因的检测和鉴定：DNA分子杂交/分子杂交/抗原抗体杂交/个体生物学水平的鉴定；5、最后，将成功表达的细胞导入植物，并鉴定植物的个体生物学水平。【小问1详解】根据题意，以玉米的RNA为模板通过逆转录过程扩增ZmBRI1基因cDNA，然后经过热稳定DNA聚合酶(或

26、TaqDNA聚合酶)催化的PCR过程可以得到大量ZmBRI1基因。因为C启动子具高转录活性，所以Ti质粒选取C启动子，目的是使基因在转基因植株细胞中高效表达。【小问2详解】将ZmBRI1基因插入Ti质粒的T-DNA中，可以采用农杆菌转化法将将ZmBRI1基因转入Ws和bril-5中。鉴定成功转入ZmBRI1基因植株的方法是PCR技术。【小问3详解】由图甲和图乙可知，转入ZmBRI1基因的突变体的植株高度和叶柄长度明显高于bril-5，与Ws基本无差别，说明ZmBRI1基因可以修复bril-5的表型；由图丙可知，ABA浓度为0时，三种植物萌发率均高，ABA浓度为0.75molL-1时，植物萌发率

27、均降低，而与bril-5相比，OE1转入了ZmBRI1基因，ZmBRI1基因表达BR受体，种子的萌发率减少相对较少。结合图甲和图乙可推测ZmBRI1基因的功能是表达BR受体，修复了BR的信号通路；降低拟南芥对ABA的敏感性。【点睛】本题考查基因工程的步骤和PCR技术，意在考查学生获取信息的能力和综合分析的能力。(2023届广东省揭阳市高三第一次教学质量测试)15. 斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，其技术流程如图。据此分析，下列说法正确的是（ ）A. 放射性自显影技术可显示原培养皿中含目的基因的菌落位置B. p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基排列顺序相同C. p和q片段的杂交

28、双链区域形成过程中有氢键和磷酸二酯键生成D. 斑点印迹杂交技术可用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达【答案】A【解析】【分析】目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。【详解】A、斑点印迹杂交技术是将目的基因片段用放射性同位素或荧光进行标记，与受体细胞的基因组DNA进行杂交，如果目的基因整合到受体细胞上，那么标记基因就会与其结合，通过放射性自显影就可以检测出整合有目的基因的受体细胞。所以该技术可以显示原培养基中含目的基因的菌落位置

29、，A正确；B、p和q杂交是因为两单链的碱基可以互补配对，B错误；C、在杂交过程中，双链区域会有氢键形成，但不会形成磷酸二酯键，C错误；D、斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，该技术可以检测目的基因的导入和转录，但无法用于检测目的基因是否在受体细胞中表达，目的基因是否在受体细胞中表达常用抗原-抗体杂交法，D错误。故选A。(2023届广东省揭阳市高三第一次教学质量测试)21. 中国科学家采集了某深海海域的沉积物样品，分离、鉴定得到其中的深海放线菌，以期获得具有前景的抗生素替代品。据此回答下列问题：（1）研究人员欲筛选出深海放线菌进行研究，取1g沉积物样品接种在液体培养基中摇瓶培养，稀释后取

30、菌液通过_法接种到高氏一号（加数滴质量分数为10的酚）培养基表面以获得单菌落。培养基中的酚能抑制细菌等杂菌的生长，而放线菌能在该培养基上正常生长，这种培养基属于_（填“选择”或“鉴别”）培养基。（2）通过PCR技术扩增分离得到的放线菌的16S rRNA基因可进行菌株的种属鉴定。PCR技术中起关键作用的酶是_。该技术能在放线菌总的DNA中专一性扩增出16S rRNA基因的原因是_。PCR产物一般可通过_鉴定。（3）紫色杆菌的紫色菌素（一种毒素，致死率高）能使培养基呈紫色，已知呋喃酮C30能明显抑制紫色菌素的产生。研究人员筛选出了放线菌菌株A，用甲醇将菌株A发酵产物提取后配制成溶液，对提取物能否抑

31、制紫色菌素的产生进行了研究。将紫色杆菌菌液均匀地涂布在培养基表面，待菌液干燥后，将无菌圆纸片贴于培养基表面，按图1所示在滤纸片上滴加溶液。该实验以_组为对照，通过比较A、B、C三组的_可知提取物是否能抑制紫色菌素的产生。实验表明甲醇溶液不会影响紫色杆菌的繁殖，培养过程中对A、B、C三组紫色杆菌的数量进行监测，结果如图2所示，据图推测，深海放线菌A的提取物作为抗生素替代品的优点是_。【答案】（1） . 稀释涂布平板#涂布平板 . 选择 （2） . 耐高温的DNA聚合酶 . 引物能与16S rRNA基因特异性结合#引物是根据16S rRNA基因一段已知序列设计合成的 . 琼脂糖凝胶电泳 （3） .

32、 A、C . 褪色（透明）圈直径 . 不会影响致病菌的生长，从而不会胁迫致病菌使其产生耐药性#不易对致病菌形成选择压力而导致其产生耐药性【解析】【分析】PCR反应过程：变性复性延伸。变性：当温度上升到90以上时，双链DNA解聚为单链，复性：温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸：72左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5端向3端延伸。【小问1详解】分离和纯化微生物常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，题干信息提示菌液已经先经过稀释，推知这里的接种方法是稀释涂布平板法。该培养基允许放线菌生长，同时抑制或阻止其他细菌等杂菌的生长，推知该培养基为选择培养基。

33、【小问2详解】PCR技术变性（90以上）、复性（50左右）、延伸（72左右）阶段需要的温度都比较高，所以需要耐高温的DNA聚合酶。引物是一段能与DNA母链部分碱基互补配对的短单链核酸，因此能特异性扩增出目的基因片段，该PCR中引物能与16S rRNA基因特异性结合，因此能在放线菌总的DNA中专一性扩增出16S rRNA基因。PCR扩增的产物是DNA分子，DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH条件下，这些基团可以带上正电荷或者负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带的电荷相反的电极移动，因此PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。【小问3详解】研究提取物的作用时，一般需要设置空白对照和

34、阳性对照。由题干可知呋喃酮C30能明显抑制紫色菌素的产生，推知阳性对照滴加5L呋喃酮C30，而菌株A发酵产物通过甲醇提取，推知空白对照滴加5L甲醇溶液，即该实验以A、C组为对照。由于紫色菌素使得培养基呈紫色，若提取物能抑制紫色菌素产生，则会产生褪色圈（透明圈），根据褪色圈的直径即可推知其抑制作用大小。由图8可知，滴加呋喃酮C30和菌株A提取物后，紫色杆菌的数量与空白对照组（滴加甲醇溶液）差别不大，推知提取物不会影响致病菌的生长，但是致病菌产生的紫色菌素却有区别，推知提取物不会对致病菌进行选择，使得其不会产生耐药性。(2023届广东省深圳市高三第一次调研考试)21. 表面展示技术是通过重组DNA

35、技术，将外源蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而可展示在细胞表面。回答下列问题。（1）若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，下图中最适合通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达的是_。A. B. C. D. 注:Ampr为氟卡青霉素抗性基因;表示转录方向;UAG，UAA，UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。（2）芽孢表面蛋白是实现表面展示技术的关键蛋白，结合上述材料，试分析该蛋白在表面展示技术中的作用是_。（3）导入基因表达载体后的芽孢杆菌接种在含有_的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的

36、_培养。（4）培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含_的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，常用酒精初步分离DNA和蛋白质，这里酒精的作用原理是_。（5）若要确定表面展示技术在芽孢杆菌上构建成功，应在紫外光环境下对其进行_水平的检测。【答案】（1）C （2）芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示/定位在芽孢杆菌表面 （3） . 氮苄青霉素#Amp . 选择 （4） . 空载体（不含目的基因的载体、不含外源基因的载体） . DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 （5）个体#细胞【解析】【分析】基因工程的基本步骤包括目的基因的获取、构建基因表达载

37、体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。【小问1详解】若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，则需要将cotB和gfp一起表达，即使用一个启动子和终止子，并且cotB在前，gfp在后，才能通过绿色荧光（绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光）确定融合蛋白成功表达，为了能够顺利表达gfp则cotB不能提前终止，所以cotB不能是终止密码子，则只有C符合题意，C正确。故选C。【小问2详解】蛋白在表面展示技术中的作用是芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示（定位在芽孢杆菌表面）。【小问3详解】由于表达载体中含有

38、Ampr基因，则若转基因成功能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长，所以可以将芽孢杆菌接种在含有氨苄青霉素的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的选择培养。【小问4详解】培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含空载体（不含目的基因的载体、不含外源基因的载体）的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，然后进行鉴定，由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以可以用酒精初步分离DNA和蛋白质。【小问5详解】由于绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光，所以可在紫外光环境下对芽孢杆菌进行个体（细胞）水平进行检测。(2023届广西柳州市高三第二次模拟考试理综)12. 中国科学院遗传与

39、发育生物学研究所李传友团队提出了一种利用多重基因编辑技术以红果番茄（双子叶植物）为材料，快速定向创制七种不同果色番茄材料的策略。该研究利用多重基因编辑系统靶向敲除了红果番茄中控制三类色素合成或代谢的关键基因。下图是科研人员用CRISPR-Cas9基因编辑技术定点敲除目标基因的示意图，请回答下列问题：（1）CRISPR-Cas9系统能精准识别相关基因，依据的原理是_发生碱基互补配对；Cas9蛋白能使目标DNA中的_（填化学键名称）断裂，从而实现对_（选填“DNA单链”、“DNA双链”、“RNA单链”、“RNA双链”）的剪切。若要插入其他基因，可以利用_酶将它们连接起来。（2）研究人员将编辑好的基

40、因导入番茄的体细胞，常用的方法是_。该方法的优点是可以使目的基因进入植物细胞，并_，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。（3）含有编辑好的基因的番茄体细胞具有全能性，在一定的营养和激素等条件下，可以经过_的过程形成愈伤组织。当培养基中的_时，主要诱导根原基的形成。（4）五彩缤纷的水果和蔬菜不仅给人以美的视觉享受，还能提高消费者的购买欲。在培育彩色番茄的同时我们还需要考虑该策略对番茄的_等性状无影响。【答案】（1） . 向导DNA与目标RNA（或识别序列） . 磷酸二酯键 . DNA双链 . DNA连接 （2） . 农杆菌转化法 . 将其插入到植物细胞中的染色体的DNA上 （3） . 脱分化

41、 . 生长素含量高于细胞分裂素 （4）单果重、单株产量、维生素C含量等【解析】【分析】基因工程中用限制性内切酶切割目的基因和载体，以获得相应的黏性末端，以构建表达载体。将目的基因导致植物受体细胞，常用农杆菌转化法。【小问1详解】由图可知，向导RNA与目标DNA有相应的识别序列能特异性结合，使得CRISPR-Cas9系统能精准识别相关基因。Cas9蛋白相当于限制性内切酶，能使目标DNA中的磷酸二酯键断开，从而实现对DNA双链的剪切。DNA连接酶具有连接DNA片段的功能。【小问2详解】将目的基因导致植物受体细胞，常用农杆菌转化法。该方法可将目的基因插入到植物细胞中的染色体的DNA上。【小问3详解】

42、高度分化的番茄体细胞经脱分化可形成愈伤组织。当培养基中生长素含量高于细胞分裂素时，主要根的分化，当生长素含量低于细胞分裂素时，主要诱导芽的分化。【小问4详解】在培育番茄等农产品时，除了要农产品颜色好看，给与人们视觉享受外，还应考虑产量和营养成分等，所以要考虑该策略对番茄的单果重、单株产量、维生素C含量等性状有无影响。(2023届黑龙江省大庆市高三第一次教学质量检测)24. 用基因工程技术向某棉花细胞中导人两个抗虫基因，基因导入的位置是随机的，将该细胞经植物组织培养培育成植株后让其自交，理论上子代植株中抗虫：不抗虫的值不可能是（）A. 9：7B. 3：1C. 15：1D. 1：0【答案】A【解析

43、】【分析】基因自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离的同时，位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合。【详解】A、两个抗虫基因导入棉花细胞的情况只有BCD选项的三种情况，则子代植株中抗虫：不抗虫的值不会出现9：7，A错误。B、若两个抗虫基因都导入了一条染色体上，则产生的配子中含抗虫基因与不含抗虫基因的比例为1：1，则子代植株中抗虫：不抗虫的值为3：1，B正确；C、两个抗虫基因位于两条非同源染色体上，则在减数分裂过程中，产生的配子中含抗虫基因与不含抗虫基因的比例为3：1，因此，子代植株中抗虫：不抗虫的值为15：1，

44、C正确；D、若两个抗虫基因都导入了一对同源染色体上，则产生的配子中都含抗虫基因，则子代植株中抗虫：不抗虫的值为1：0，D正确。故选A。(2023届黑龙江省大庆市高三第一次教学质量检测)35. 2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法错误的

45、是（）A. 若要对一个基因进行编辑，则通常至少需要设计两个序列不同的sgRNA 目标DNAmB. sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯键C. 有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低D. 为降低免疫排斥反应，可通过CRISPR/Cas9技术敲除相关抗原蛋白基因【答案】C【解析】【分析】1.基因工程中的操作工具及其作用：“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶），能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。“分子缝合针”DNA连接酶，EcoliDNA连接

46、酶，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合黏性末端和平末端。“分子运输车”载体。2.移植的器官会被人的免疫系统视作抗原加以攻击，使用免疫抑制剂可以减轻免疫排斥反应。【详解】A、若要对一个基因进行编辑，由于基因含有两条互补的单链，因而通常至少需要设计两个序列不同的sgRNA 与目标DNA的两条链进行配对，A正确；B、由于DNA和RNA之间可进行碱基互补配对，因而sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯键进而可以将目标基因剪切下来，B正确；C、sgRNA序列越短，DNA分子上与其互补的特定序列会越多，错误结合概率越高，脱靶率越

47、高，C错误；D、为降低免疫排斥反应，可通过CRISPR/Cas9技术敲除相关抗原蛋白基因，进而可避免免疫排斥反应发生，为异体器官抑制提供保障，D正确。故选C。(2023届黑龙江省大庆市高三第一次教学质量检测)40. 随着社会的发展，人们对抗生素的需求量日益增大。干扰素是一种应用广泛的蛋白质类抗生素，基因工程技术已成为获得优质干扰素的重要途径之一。人们利用大肠杆菌获得目的干扰素的过程如图1所示。回答下列问题：（1）图1中获得干扰素基因需要用到_酶，该种酶_（填“具有”或“不具有”）特异性。已知将重组质粒“移植”入大肠杆菌前，需要将大肠杆菌用Ca2+进行处理，这样做的目的是_。（2）目的基因的部分

48、碱基序列如图2所示，不同限制酶的切割位点如表所示，则切割目的基因可选择_和_两种限制酶。限制酶NcoISphINheIBamHI识别序列和切割为点5-CCATGG-35-GCTAGC-35-GGATCC-35-GCTAGC-3（3）在分子水平上，可采用_和_的方法检测目的基因是否在受体细胞中成功表达。若成功表达，则说明人和大肠杆菌在基因表达过程中共用一套_。【答案】（1） . 限制 . 具有 . 使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 （2） . NcoI . NheI （3） . PCR技术 . 抗原抗体杂交 . 遗传密码子#密码子【解析】【分析】基因工程技术的基本步骤：

49、（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗

50、原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【小问1详解】从淋巴细胞中获取干扰素基因需要用限制酶切割DNA，限制酶具有特异性。大肠杆菌需事先用Ca2+进行处理，增大细胞壁的通透性，使之处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。【小问2详解】据图可知，目的基因的部位序列中含有-GGATCC-和-CCATGG序列，故可选择NcoI和NheI两种限制酶进行切割。【小问3详解】检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因用DNA分子杂交技术，若目的基因成功表达，则需要检测RNA和蛋白质，则检测方法是PCR技术和抗原抗体杂交技术。人的基因能在大肠杆菌细胞中成功表达，说明人和大肠杆

51、菌共用一套密码子(2023届湖北省高三高考仿真模拟测试)16. 关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）A. 过滤液沉淀过程在4冰箱中进行是为了防止DNA降解B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质【答案】B【解析】【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA

52、进一步分离；在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。故选B。(2023届湖北省高三高考适应性模拟测试（三）)17. 自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其

53、激活基因（sfp）构建基因表达载体（如下图），通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述错误的是（ ）A. 上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因B. 将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeI和BamHIC. sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的D. 农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上【答案】B【解析】【分析】由图可知，将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeI和BamHI，则会将终止子一同切除，故只能用BamHI；将idgS基因插入Ti质粒时可用SpeI和SacI以避免产生的粘性末端

54、环化，增加构建成功的概率。【详解】A、靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确；B、将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeI和BamHI，则会将终止子一同切除，故只能用BamHI，B错误；C、sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，C正确；D、将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。故选B。(2023届湖南省株洲市高三教学质量统一检测（一）)21. 在聚合酶链式反应（PCR）中，除了作为复制对象的长链DNA之外，反应溶液中还添加有作为引物的短链DNA、

55、dNTP（脱氧三磷酸核苷酸，N表示任意某一种碱基）和酶。实验时需要使反应溶液的温度周期性地发生变化以完成“变性复性延伸”的循环。DNA复性温度与互补碱基对之间的氢键数呈正相关。（1）PCR反应溶液中添加的酶为_，作用是_。（2）实验1：在图1的引物1到引物4中，只使用1种作为引物，复性的温度设定为T，PCR后只合成出了与模板DNA2相同的单链。该实验使用的引物是_。实验2：将引物变更为图1中的引物3和引物4，其他条件与实验1相同的情况下进行PCR双链DNA完全没有被复制，请在答题卡中，将引物3和引物4与模板链结合的关系绘制出来。_（3）实验3：对图2中的双链DNA，使用引物5和引物6，将复性的

56、温度设定为T，进行了PCR。结果是双链DNA完全得不到复制。而当设定温度改变后，双链DNA得到了复制。温度改变的大致思路是_。（4）实验4：PCR技术与电泳鉴定结合进行DNA测序。以待测序的DNA链作为模板链，使用3TATAATGCGCA-5末端结合了高灵敏度检测化合物X的DNA单链序列作为引物，在第1次实验中，用dNTP进行反应。第2次实验，在第1次实验使用上述dNTP的基础上，将反应混合物分为四个试管，分别加入四种双脱氧三磷酸核苷酸即ddNTP，即核苷酸在2、3号都脱氧（ddATP、ddCTP、ddTTP、ddGTP，结构见图4），每个试管只加一种。第1次与第2次实验四只试管，在经过相同的

57、温度变化循环后，对反应溶液进行了适当的处理，使全部的DNA以单链DNA的形式存在。使用能区分开一个碱基长度差异的凝胶电泳法对含有化合物X的单链DNA进行分析，获得了如图5所示的结果。ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止，原因是_。请根据下图写出模板链碱基序列：_【答案】（1） . 耐高温的DNA聚合酶（或Taq酶） . 将游离的脱氧核苷酸链接到引物的3端 （2） . 引物-2 . （3）适当降低复性温度 （4） . ddNTP的2、3号碳上都脱氧，参与聚合反应后无法与游离脱氧核苷酸形成磷酸二酯键 . 5TAGCGTAGTA3【解析】【分析】聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩

58、增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。【小问1详解】PCR是体外扩增DNA技术，高温可以解旋，耐高温的DNA聚合酶（或Taq酶）可以将脱氧核苷酸连接到引物的3端聚合成大分子DNA。【小问2详解】1种引物

59、只能与DNA的一条链相结合，以一条链为模板，合成一段DNA，PCR后只合成出了与模板DNA2相同的单链，因此所选引物应该是与模板DNA1的3端相结合，并且互补配对，则对应的为引物2；引物只能与模板链的3端互补配对，且从3端开始复制，引物3和引物4与模板链结合的关系绘制为 。【小问3详解】PCR过程是利用温度变化来进行DNA的体外复制，适当降低复性温度，可以使改变后的引物更好结合，从而使扩增成功。【小问4详解】ddNTP的2、3号碳上都脱氧，参与聚合反应后无法与游离脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，因此ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止。根据图5可知，ddATP、ddCTP、ddTTP、

60、ddGTP对应的条带出现，分别代表对应的碱基A、C、T、G出现，而DNA新链合成方向是从5端3端，加入ddTTP后出现的条带最小，说明新链第一位碱基为T，模板链3端即起始端为A，而条带第二小的位置为加入ddATP，说明新链第二个碱基为A，模板链3端第二个碱基为T，以此类推，模板链从3端对应的序列为图5从下往上对应的碱基互补的碱基，即3ATGATGCGAT5，也即5TAGCGTAGTA3。(2023届江苏省南京市、盐城市高三第一次模拟考试)24. 人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2（ALDH2）是人体酒精代谢中的关键酶。研究人员利用定点诱变技术对ALDH2基因进行改造后在大肠杆菌中表达，获得具有较好溶

61、解性的乙醛脱氢酶2。所用质粒和操作过程如下图。其中，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Ampr转录的模板链属于a链的片段。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端（其中一条链）的序列为5-ATCCATGCGGCTC（中间核苷酸序列）CAGTGTAGCG-3。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：限制酶BamHIPstIXhoIXbaI识别序列和切割位点（53）GGATCCCTGCAGCTCGAGTCTAGA（1）通过定点诱变技术可制备自然界原本_（选填“存在”或“不存在”）的蛋白质。（2）质粒复制的模板链是_（选填“a”

62、、“b”、“a和b”、“a或b”）链，基因Tetr转录的模板链属于_的片段。若用XhoI切割质粒后，形成的单链末端碱基序列为_。（3）过程需要的酶是_。过程常采用_处理以提高操作效果。经过程，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有_。（4）为扩增目的基因，某同学设计了如下六种PCR引物，其中可选用（符合题意）的一对引物是_（选填数字序号）。根据选定的引物，至少需经过_次循环，可获得32个符合要求的目的基因。5-TCTAGAATCCATGCGCTC-3 5-TCTAGACGCTACTCACTG-35-CTGCAGATCCATGCGCTC-3 5-GGATCCCGCTACTCACTG-35-GGAT

63、CCATCCATGCGCTC-3 5-CTCGAGCGCTACTCACTG-3【答案】（1）不存在 （2） . a和b . b链 . TCGA-#AGCT （3） . 限制酶（或BamH、XabI）和DNA连接酶 . Ca2+#CaCl2 . 导入空白质粒的和导入重组质粒的 （4） . . 6【解析】【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细

64、胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【小问1详解】定点诱变技术属于蛋白质工程，蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达形状，合成新的蛋白质，从而制造出自然界原本不存在的蛋白质。【小问2详解】质粒的a和b两条链都作

65、为模板进行复制，Tetr的转录方向与Ampr的转录方向相反，说明Tetr的转录模板和Ampr转录模板不在一条链上，Ampr转录的模板链属于a链的片段，则Tetr的转录模板链属于b链的片段。XhoI的识别序列为CTCGAG，则若用XhoI切割质粒后，形成的单链末端碱基序列为TCGA-（或-AGCT）。【小问3详解】质粒中有两个XhoI识别切割位点，且均位于标记基因中中，过程是构建重组质粒，因此需要限制酶BamH、XabI切割目的基因和质粒，需要DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来。过程是将重组质粒导入受体细胞，一般需要用Ca2+处理大肠杆菌，形成感受态，易于接受外来DNA。重组质粒和空白质粒都可

66、能导入受体细胞，所以经过程，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有导入空白质粒的和导入重组质粒的菌落。【小问4详解】PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3端通过碱基互补配对结合。根据ALDH2基因编码区首端到末端的序列为5-ATCCATGCGGCTC（中间核苷酸序列）CAGTGTAGCG-3，且引物5端需要添加BamH、XabI的识别序列，可推测逆转录得到的脱氧核苷链为5-TCTAGACGCTACTCACTG-3，5-GGATCCATCCATGCGCTC-3 ，即符合题意。利用PCR技术可以扩增目的基因，根据DNA半保留复制的特点，需要5次循环可获得32个符合要求的目的基因。(202

67、3届江苏省南通市高三第一次调研测试)24. 通常真核细胞翻译的起始必须依赖于mRNA的5端帽子结构，而内部核糖体进入位点（IRES）则是位于mRNA内部的核糖体识别、结合序列，IRES使翻译可以从mRNA内部开始。人溶菌酶和人乳铁蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，科研人员构建人溶菌酶基因（hLYZ）和人乳铁蛋白基因（hLTF）双基因表达载体，并获得转基因牛胚胎。下图表示双基因表达载体的主要构建过程，请回答下列问题。（1）IRES的基本单位是_，翻译时核糖体在mRNA移动方向是_（53或35）。与两个基因直接连接形成融合基因相比，两个基因之间插入IRES序列的意义是_。（2）为实现hLTF与IRES序

68、列的连接，在PCR扩增基因片段时通常在引物的5端添加特定的限制酶识别序列，而不在3端添加的原因是_。（3）过程中，用_切割质粒a、b后，再用_（方法）分离，收集质粒a的hLTF片段，与质粒b的大片段连接，获得重组质粒1。（4）过程中，用BamH分别处理重组质粒1和质粒c，再连接形成的重组质粒不止一种，这是因为_。用BamH对重组质粒2进行酶切，获得的DNA片段大小为_。（5）科研人员以包含重组质粒2的脂质体转染乳腺上皮细胞时，在细胞培养液中加入一定浓度的新霉素的主要目的是_。选择乳腺上皮细胞作为受体细胞便于检测_。（6）研究人员试图以转hLYZ与hLTF的奶牛乳腺上皮细胞作为供体细胞，培养转基

69、因克隆胚胎，在此过程中主要涉及的现代生物技术有_。【答案】（1） . 核糖核苷酸 . 53 . 便于得到两种具有功能的蛋白质（一种mRNA可翻译形成两种蛋白质） （2）使引物的3端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸 （3） . XbaI和NheI . 电泳法 （4） . 目的基因与质粒c存在正反连接、目的基因多拷贝与质粒c连接等 . 3.2kb和8.2kb （5） . 便于筛选导入重组质粒2的牛乳腺上皮细胞 . hLYZ和hLTF（目的基因）能否表达 （6）体细胞核移植技术、早期胚胎培养技术（动物细胞培养技术、卵母细胞采集与培养技术）【解析】【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获

70、取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。

71、个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【小问1详解】IRES是mRNA上的位点，则是RNA的一个片段，则IRES的基本单位是核糖核苷酸，mRNA的翻译方向是53，则核糖体在mRNA移动方向是53。IRES是核糖体的识别位点，则两个基因之间插入IRES序列便于得到两种具有功能的蛋白质（一种mRNA可翻译形成两种蛋白质）。【小问2详解】DNA的两条链是反向平行的，使引物的3端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸，则需要在引物的5端添加特定的限制酶识别序列。【小问3详解】酶切位点不能破坏标记基因，还要保留IRES序列和启动子序列，则过程中，用XbaI和NheI切割质粒a、b，由于不同长度

72、的片段在电场中的移动速度不同，所以可用电泳法分离酶切片段，收集质粒a的hLTF片段，与质粒b的大片段连接，获得重组质粒1。【小问4详解】由于可能目的基因与质粒c存在正反连接、目的基因多拷贝与质粒c连接等，所以过程中，用BamH分别处理重组质粒1和质粒c，再连接形成的重组质粒不止一种。重组质粒1的长度为5.9kb，质粒c的长度为8.2kb，过程只能用BamH酶切重组质粒1和质粒c然后再连接，但是重组质粒2的长度为11.4kb，则用BamH对重组质粒2进行酶切，获得的DNA片段大小为3.2kb和8.2kb。【小问5详解】重组质粒2上面有新霉素的抗性基因，则用含重组质粒2的脂质体转染乳腺上皮细胞时，

73、在细胞培养液中加入一定浓度的新霉素可筛选导入重组质粒2的牛乳腺上皮细胞。人溶菌酶和人乳铁蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，则人溶菌酶基因（hLYZ）和人乳铁蛋白基因（hLTF）在乳腺细胞中表达，所以乳腺上皮细胞作为受体细胞便于检测hLYZ和hLTF（目的基因）能否表达。【小问6详解】以转hLYZ与hLTF的奶牛乳腺上皮细胞作为供体细胞，培养转基因克隆胚胎，首先用到卵母细胞采集与培养技术获得受体细胞，需要用到体细胞核移植技术构建重组细胞，还要用到动物细胞的培养技术培养重组细胞，然后通过早期胚胎培养技术进行体外培养胚胎。(2023届江西省新八校高三上学期第一次联考理综)12. 科研人员以病毒表面S蛋白作

74、为主要的病毒抗原，利用基因工程研制疫苗用于接种预防，简要过程如图所示。回答下列问题：（1）新冠病毒是一种RNA病毒，一般先通过_得到cDNA，再经PCR技术获取大量S蛋白基因，PCR的中文全称是_。（2）PCR技术还需用到_酶，该酶能够使脱氧核苷酸从引物的_端开始连接，据下图分析，可选择的引物是_。（3）为了验证表达的S蛋白与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，请设计简单的检测方案并预期检测结果。方案:_。结果:_。【答案】（1） . 逆转录 . 多聚酶链式反应 （2） . 热稳定DNA 聚合酶#Taq酶 . 3 . II、 （3） . 用表达的S蛋白与新冠病毒肺炎康复患者血清进行抗原-抗体杂交实

75、验 . 出现杂交带【解析】【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链。【小问1详解】利用 RNA 得到相应 DNA的方法为逆转录，起作用的酶为逆转录酶。在体外将 DNA 扩增的技术是 PCR，中文名称为多聚酶链式反应。【小问2详解】PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，该过程需要热稳定DNA聚合酶

76、（Taq酶），热稳定 DNA聚合酶(Taq酶)能够使脱氧核苷酸从引物的 3端开始连接，使子代 DNA从5向3延伸；进行扩增时，还应选择一对方向相反的引物，且与模板的 3端结合，据图可知，应选择 、。【小问3详解】细胞内是否合成了由目的基因控制的蛋白质，使用抗原-抗体杂交法检测，为了检验表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用S蛋白与新冠病毒肺炎康复患者血清进行抗原-抗体杂交实验来进行检测，本实验是验证性实验，实验结果是唯一的，因此本实验结果是出现杂交带。(2023届江西省重点中学协作体高三第一次联考理综)12. 花是重要的经济作物，多年来由于棉铃虫的危害导致一定程度的减产。科研人

77、员将某细菌的抗虫基因A转入棉花细胞内，成功获得了抗虫转基因棉花。这在一定程度上减少了杀虫剂的使用，提高了棉花的产量和质量。请回答下列问题：（1）与细菌中的A基因相比，从cDNA文库中获取的抗虫基因A不具有_等组件。（2）利用农杆菌转化法将A基因导入棉花体细胞，需先将A基因插入到质粒的T-DNA中，原因是_。（3）为培育出抗虫转基因棉花植株，应将_接种到适宜培养基进行植物组织培养，最后还需在个体水平做_的接种实验。（4）RT-PCR是以mRNA作为模板扩增得到DNA的技术，与传统PCR相比，进行 RT-PCR时需额外添加的酶是_。（5）由于科学发展水平的限制，目前对_及基因的调控机制等都了解得相

78、当有限。因此，在将转基因植物应用于商业化生产之前，必须对其进行安全性评估。【答案】（1）启动子、终止子 （2）农杆菌的Ti质粒上的T-DNA能进入棉花细胞并整合到染色体DNA上，吸引农杆菌对棉花细胞进行侵染 （3） . 含有A基因棉花体细胞 . 棉铃虫 （4）逆转录酶 （5）基因的结构、基因间的相互作用【解析】【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因

79、导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【小问1详解】从cDNA文库中获取的抗虫基因A是由mRNA逆转录而来，不具有启动子、终止子等调控基因表达的组件。【小问2详解】利用农杆菌转化法将A基因导入棉花体细胞，需先将A基因插入到质粒

80、的T-DNA中，原因是农杆菌的Ti质粒上的T-DNA能进入棉花细胞并整合到染色体DNA上，吸引农杆菌对棉花细胞进行侵染。【小问3详解】为培育出抗虫转基因棉花植株，应将含有A基因的棉花体细胞接种到适宜培养基上。这个细胞先经过脱分化形成愈伤组织，再分化成胚状体，并逐渐发育成完整植物体。验证棉花植株的抗虫性，需要在个体水平上做接种适量棉铃虫的接种实验。【小问4详解】由RNA到DNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。【小问5详解】目前对基因的结构、基因间的相互作用及基因的调控机制等都了解得相当有限。因此，转基因技术需要进行充分的安全性评估。(2023届辽宁省沈阳市高三教学质量监测（一）)15. PC

81、R又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）A. 以DNA半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行B. 耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5端开始连接脱氧核苷酸C. 反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步D. 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物【答案】B【解析】【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温

82、控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。【详解】A、PCR是体外进行DNA复制，以半保留复制为原理，为了维持反应的稳定，反应需要在缓冲液中进行，A正确；B、耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3端开始连接脱氧核苷酸，B错误；C、反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，C正确；D、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。故选B。(2023届宁夏吴忠市高三下学期一轮联考理综)12. CRISPRCas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及

83、外源DNA，受此机制启发，科学家们研发了CRISPRCas9基因编辑技术，这是一种对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，其原理是由一个向导RNA分子引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的任一目标位点进行切割（见下图）。（1）CRISPRCas9基因编辑复合体中Cas9蛋白是由相应基因指导，在细胞的_中合成的，其工作原理是特异性的切断目标DNA的_（填具体部位）；向导RNA中的识别序列与目标DNA的识别遵循_原则，该复合体中，决定其在DNA上切割位点的是_。（2）中国科学家从肺癌患者血液中提取某种细胞，利用CRISPRCa

84、s9基因编辑技术加入一个帮助这种细胞定向清除肿瘤的新基因序列，然后再把这些细胞注入患者的血液，以达到杀死癌细胞的目的。这些细胞应该是人体的_，这种治疗方法属于_（填“体内”或“体外”）基因治疗。（3）分析上述信息可知，CRISPRCas9基因编辑技术与早期基因工程相比最明显的优势是_。【答案】 . 核糖体 . 磷酸二酯键 . 碱基互补配对 . 向导RNA中的识别序列 . T淋巴细胞 . 体外 . CRISPRCaS9基因编辑技术可人为地选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强【解析】【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位

85、的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。2、紧扣题干信息“通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割”准确答题。【详解】（1）CRISPRCas9基因编辑复合体中Cas9蛋白是由相应基因指导，在细胞的核糖体中合成的，其工作原理是特异性的切断目标DNA的磷酸二酯键；向导RNA中的识别序列与目标DNA的识别遵循碱基互补配对原则，该复合体中，决定其在DNA上切割位点的是向导RNA中的识别序列。（2）这种细胞定向清除肿瘤的新基因序列，然后再把这些细胞注入患

86、者的血液，以达到杀死癌细胞的目的。这些细胞可以杀死癌细胞可判断其应该是人体的T淋巴细胞，这种治疗方法属于体外基因治疗。（3）分析上述信息可知，与早期基因工程相比，CRISPRCas9基因编辑技术可以对特定位点进行编辑，故其最明显的优势是可人为地选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强。【点睛】本题考查了基因表达、基因工程、基因治疗等相关知识，意在考查学生的理解和应用所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力(2023届山东省济南市高三下学期学情检测（一模）)13. 在基因工程中可利用PCR进行体外DNA片段的扩增，PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列说法错误的是（ ）A. PCR利用

87、了DNA热变性的原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚及与引物的结合B. PCR扩增的特异性一般是由引物的特异性决定的C. 琼脂糖凝胶中的DNA分子和扩增的引物被核酸染料染色后，可在紫外灯下检测出来D. DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象有关【答案】C【解析】【分析】1、DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。2、PCR原理：在高温作用下，打开DN

88、A双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链。【详解】A、在PCR技术的过程中包括：高温变性（解链）低温复性中温延伸三个步骤，因此DNA两条链的解旋过程不需要解旋酶的催化，而是利用了DNA在高温下变性的原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，A正确；B、由于引物的序列具有特异性，所以PCR扩增的特异性一般是由引物的特异性决定的，B正确；C、凝胶中的DNA分子

89、通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，所以琼脂糖凝胶中的DNA分子和扩增的产物（DNA）被核酸染料染色后，可在紫外灯下检测出来，C错误；D、DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关，一般DNA分子越大，迁移速度越慢，大分子物质在通过琼脂糖时受到较大阻力，因此双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，D正确。故选C。(2023届山东省济南市高三下学期学情检测（一模）)15. 循环阈值（Ct值）是通过一定的技术手段，使病毒的扩增产物达到可检测水平所需的循环次数。新冠肺炎诊疗方案（第九版）把感染者出院标准规定为两次核酸检测Ct值均35。下列说法错

90、误的是（ ）A. Ct值为40和Ct值为35的核酸扩增产物的量可能相等B. Ct值越高，则表示病毒浓度越高，检测所需的时间越长C. 一般来说，确诊者出现症状时，Ct值较低，体内病毒浓度较高D. 质量分数75%的酒精可使新冠病毒的蛋白质变性从而达到消杀的目的【答案】B【解析】【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。其原理是DNA的复制。PCR的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、2种引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR共包括三步：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DN

91、A上；中温延伸：合成子链。【详解】A、由于不同的人体内的病毒含量不同，所以Ct值为40和Ct值为35的核酸扩增产物的量可能相等，A正确；BC、Ct值（循环阈值）的含义为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，所以Ct值越大表示循环的次数越多，因此样本中病毒的数目越少，Ct值越高，则表示病毒浓度越低，检测所需的时间越长，Ct值较低，体内病毒浓度较高，B错误，C正确；D、新冠病毒的组成成分是蛋白质和RNA，质量分数75%的酒精可使蛋白质变性，所以质量分数75%的酒精可使新冠病毒的蛋白质变性从而达到消杀的目的，D正确。故选B。(2023届山东省济南市高三下学期学情检测（一模）)20. 为

92、了构建重组DNA疫苗，可将不同的抗原DNA片段进行重组，图中A、B载体有三个酶切位点，其中Bcl 和BamH 识别并切割的核苷酸序列相同，如图所示。现对A载体和B载体分别进行双酶切得到含A载体片段和含B载体片段，经DNA连接酶得到BA载体，需要使用的酶分别是（ ）选项A载体B载体ABCDA. AB. BC. CD. D【答案】A【解析】【分析】基因表达载体的构建（核心）。目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。【详解】A载体用和酶切，保留BamH与A相连，B载体用和酶切，保留Bcl 与A相连，然后用DN

93、A连接酶将A载体片段和B载体片段连接，得到BA载体，A正确。故选A。(2023届山东省济南市高三下学期学情检测（一模）)25. 研究发现，大部分白血病患者细胞中存在异常的融合基因UBA2WTIP，可作为检测白血病的特异性分子标志物。科研人员通过RTPCR方法克隆得到融合基因UBA2WTIP，为了研究该基因的作用和致病机制，需要构建重组载体并把目的基因和FLAG标签基因序列连接起来，分别获得带有FLAG肽链的UBA2WTIP融合蛋白和WTIP蛋白。FLAG肽链由8个氨基酸残基组成，可作为基因工程中蛋白质是否表达的标记。（1）科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总RNA为模板，经过_过程合成cDN

94、A，设计_种引物，经RTPCR扩增出融合基因UBA2WTIP。对测序结果进行数据分析，推测融合基因UBA2WTIP是在UBA2基因的第16外显子与WTIP基因的第2外显子处拼接而成，如图1所示。为了验证该融合基因的产生是基因组DNA融合而不是不同的RNA剪接后逆转录所产生的，可通过PCR验证，其实验思路和预期结果为_。（2）为了构建重组载体，科研人员设计了以下2种引物，如图2所示：上游引物F2为：5TATGGTACCATGGCACTGTCGCGGGGG3，GGTACC为Kpn 酶切位点；下游引物R2为：5TATTCAGAGCTCAGTGACGTG3；FLAG标签基因编码链序列（5GATTACA

95、AGGATGACGACGATAAG3）可以插入目的基因编码区的首端或者末端。已知引物中ATG对应起始密码，若UBA2WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽，则FLAG标签基因序列一般不能插入位置，原因是_；若在下游引物R2处插入FLAG标签基因序列和EcoR 酶切位点，已知引物中TCA对应终止密码，位置处序列为5_3。（3）制备的重组载体体外转染人类白血病细胞株KGla细胞，提取各细细胞总蛋白，用FLAG单克隆抗体检测蛋白表达情况，并分别测定转染空质粒的对照细胞、转录UBA2WTIP融合基因及转录WTIP基因的KG-la细胞增殖情况，结果分别如图3所示。检测相关蛋白质是否表达的方法是_；

96、上述生长曲线结果说明_。【答案】（1） . 逆（反）转录 . 2 . 提取该病人的DNA，使用图中F1和R1引物进行PCR扩增，若出现239bp扩增片段，该融合基因的融合方式是基因组水平融合。 （2） . 蛋白质前端的信号肽一般会在蛋白质成熟时被切割掉，所以不能得到带有FLAG肽链的蛋白质。 . CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC （3） . 抗原抗体杂交 . UBA2WTIP融合基因能在体外促进白血病细胞增殖，WTIP基因能抑制白血病细胞的增殖。【解析】【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体

97、的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【小问1详解】科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总RNA为模板，经过逆（反）转录过程合成cDNA。DNA分子是双链，PCR时以每一条为模板，合成子代DNA，因此需要2种引物。据图可知，如果融合基因UBA2WTIP是在UBA2

98、基因的第16外显子与WTIP基因的第2外显子处拼接而成，那么该基因长度为239bp，能以F1和R1引物进行PCR扩增，因此如果提取该病人的DNA，使用图中F1和R1引物进行PCR扩增，若出现239bp扩增片段，该融合基因的融合方式是基因组水平融合。【小问2详解】PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5端向3端延伸的，位置前面为ATG，是翻译的起始位置，若FLAG标签基因序列插入位置，UBA2WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽，蛋白质前端的信号肽一般会在蛋白质成熟时被切割掉，不能得到带有FLAG肽链的蛋白质，因此一般不能插入位置。标

99、签基因序列本身含有启动子和终止子序列，不需要在目的基因中的启动子和终止子之间，因此若在下游引物R2处插入FLAG标签基因序列和EcoR 酶切位点，引物中TCA对应终止密码，则位置为FLAG标签基因序列，FLAG标签基因编码链序列（5GATTACAAGGATGACGACGATAAG3），处序列与此互补，为5CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC3。【小问3详解】检测相关蛋白质是否表达的方法是抗原抗体杂交。据右图结果可知，与转染空质粒的对照细胞相比，转录WTIP基因的KG-la细胞增殖较少，转录UBA2WTIP融合基因的KG-la细胞增殖较多，据此可知，UBA2WTIP融合基因能在体外促

100、进白血病细胞增殖，WTIP基因能抑制白血病细胞的增殖。(2023届山东省临沂市高三一模)25. 土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因 OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，表示操作过程。限制酶BamHBclSmaSau3A识别位点及切割位点-GGATCC-TGATCG-CCCGGG-GATC-（1）过程PCR扩增 OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为_A. 5-CTTGGATGAT-3和5-TCTGTTGAAT-3B. 5-CTTG

101、GATGAT-3和5-TAAGTTGTCT -3C. 5-ATTCAACAGA -3和5-ATCATCCAAG-3D. 5-ATTCAACAGA-3和5-GAACCTACTA-3（2）根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S是_。其功能是_。（3）过程应选用_切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是_。切割后需要用_进行连接才能获得重组质粒。（4）为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加_的选择培养基上培养。培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒，原因是_。【答案】（1）A （2） . 启动子 . RNA 聚合酶识别和结合的部位，启动转录过程 （3） . Bcl I和Sma

102、 I . 防止酶切后的质粒自身环化，保证酶切后的质粒和OsMYB56按正确方向连接 . T4DNA连接酶 （4） . 四环素 . 含未重组Ti 质粒的受体细胞也会正常生长【解析】【分析】PCR技术可特异性的扩增DNA片段，关键在于引物可以和特定DNA片段的3端特异性结合，使耐高温的DNA聚合酶酶沿引物的3端延伸子链。基因表达载体一般包括启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制原点等元件。【小问1详解】图l所示碱基序列磷酸端为5端，羟基端为3端，在进行PCR操作时，引物应分别基因两条链的3端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5-CTTGGATGAT-3(上面链的引物)和5-TC

103、TGTTGAAT-3(下面链的引物)作为引物对，A正确。故选A。【小问2详解】根据基因表达载体的结构组成分析，在每个目的基因的前面要有启动子，后面要有终止子。因此CaMV35S是启动子，其功能是RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录的进行。【小问3详解】目的基因中含有限制酶BamHI的识别序列和切割位点，因此获取目的基因时不能用限制酶BamHI进行切割；为了防止目的基因和运载体切割后自身环化或不定向连接，应该选用两种限制酶进行切割，可以选择限制酶Bcl I和Sma I。酶切后的质粒和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。【小问4详解】为了筛选出含重组质粒的受体细胞，应在添加四环素的

104、选择培养基上培养；含未重组Ti 质粒的受体细胞也会正常生长，所以培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒。(2023届山东省临沂市高三一模)14. 新冠疫情的快速控制，离不开我国政府的科学决策和对新冠病毒（一种RNA病毒）的快速检测能力。荧光定量PCR可定量检测样本中DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图），荧光监测系统随时接收荧光信号变化。每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数称为循环阈值（Ct值）。下列说法正确的是（

105、 ）A. 细胞内DNA复制的引物种类与PCR所用引物种类相同B. 一个初始DNA分子经过4次循环后，得到6个等长的DNA分子C. Ct值越大，被检测样本中病毒数目越多，对被检测者的危害性越大D. 最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关【答案】D【解析】【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量的原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成

106、，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。【详解】A、细胞内DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶合成的RNA链，而PCR反应中所需的引物是人工合成的DNA或RNA链，A错误；B、一个初始DNA分子经过4次循环后，得到8个等长的DNA分子，B错误；C、Ct值越小，说明所需循环的次数越少，可以理解为样本中的病毒含量相对较高，越容易被检测到，而Ct值越高，说明所需循环的次数越多，检测到时需要更多的时间与循环，提示样本中病毒的含量相对较少，即新冠病毒含量越少，Ct值越高，新冠病毒含量越多，Ct值越低，C错误；D、题干中提出“加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光

107、分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，D正确。故选D。(2023届山东省临沂市高三一模)20. 基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速，如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列叙述错误的是（ ）A. 若某基因是从人的细胞内提取 mRNA 经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列B. 扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a、b的3-端进行子链合成C. 导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞D. 利用农杆菌转化法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上【答案】BCD【解析】【分析】将目的基因导入植

108、物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。基因表达载体常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因。标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。【详解】A、mRNA是由基因启动子后面的序列编码而来的，若某基因是从人的细胞内提取 mRNA 经逆转录形成的，则该基因中不含启动子序列，A正确；B、扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3-端进行子链合成，B错误；C、导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞，而是受精卵或早期胚胎细胞，C错误；D、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整

109、合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上，将基因转入动物细胞常用显微注射法，D错误。故选BCD。(2023届陕西省榆林市高三第一次模拟理综)12. 下表列出了4种限制酶的识别序列及切割位点，其中表示切割位点；图1表示含目的基因的DNA结构与限制酶酶切图谱，其中链为转录模板链；图2表示某质粒的结构与限制酶酶切图谱。现利用表中所列限制酶、图示目的基因和质粒构建基因表达载体，进而培育转基因植物。回答下列问题：限制酶BamHSau3ABclEcoR识别序列-GGATCD-GATC-

110、TGATCA-GAATTC-（1）运用PCR技术扩增图1所示目的基因时，需要选用的引物是引物B和_。（2）为利于目的基因的定向插入和减少随意连接，处理含目的基因的DNA片段时应选用_两种限制酶，图2中卡那霉素抗性基因的作用是_。（3）Ti质粒上的T-DNA具有可转移并整合到受体细胞_上的特性。培育转基因植物时，受体细胞可以是受精卵或分化的体细胞，而培育转基因动物只能将基因表达载体导入受精卵，原因是_。（4）转基因植物细胞经过_过程可培育成试管苗，运用的是_技术。【答案】（1）引物C （2） . BamH和EcoR . 筛选出含有目的基因的细胞 （3） . 染色体DNA . 高度分化的植物细胞仍

111、保持着全能性，但动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制 （4） . 脱分化、再分化 . 植物组织培养【解析】【分析】引物作用是使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸；农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。【小问1详解】因链为转录模板链，由图中RNA聚合酶移动的方向是从子链的53，可判断链的左端是3端，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3端

112、开始连接脱氧核苷酸，对于链引物B可以引导合成目的基因序列，故运用PCR技术扩增图1所示目的基因时需要选用的引物是引物B和引物C。【小问2详解】目基因需要接入启动子和终止子之间，用两种目的限制酶切割可将目的基因定向插入质粒，故为利于目的基因的定向插入和减少随意连接，处理含目的基因的DNA片段时应选用ECoRI、BamH两种限制酶；图2中卡那霉素抗性基因是标记基因，作用是是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。【小问3详解】农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA

113、上，故Ti质粒上的T-DNA具有可转移并整合到受体细胞染色体DNA上的特性。由于植物体体细胞全能性高于动物细胞，培育转基因植物时，受体细胞可以是受精卵或分化的体细胞，而培育转基因动物只能将基因表达载体导入受精卵。【小问4详解】转基因植物运用的是植物组织培养技术可培育成试管苗，包括脱分化和再分化两个过程，依据的原理是细胞具有全能性(2023届云南省曲靖市高三第一次教学质量检测理综)11. 第一代DNA测序技术是由桑格等科学家发明的，又称为链终止法测序，科学家用该技术测定了噬菌体X174的基因组序列，操作流程如下图所示，回答下列问题：（1）将碎片化的DNA片段连接到质粒载体中，需要用到_、_等工具

114、酶。（2）为保证放射自显影观察条带，应选用_（填“18O”或“32P”）标记ddNTP。（3）在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与DNA分子的_、_有关。（4）ddNTP法循环测序中，用到PCR技术，该技术的原理是_，加入ddNTP会使PCR反应终止的原因可能是_。【答案】（1） 限制性内切酶#内切酶#限制酶 . DNA连接酶 （2）32P （3） . DNA分子的大小和构象 . 凝胶的浓度 （4） . DNA的半保留复制#DNA复制 . 连接到子链末端的ddNTP不能再与其它游离核苷三磷酸形成3，5-碳酸二酯键，导致ddNTP一旦连接到子链末端，子链便停止延伸【解析】【分析】构建表达载体时，选

115、用限制性内切酶将目的基因和载体进行切割，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶将DNA片段连接起来形成表达载体。在DNA复制子链延伸过程中，连接到子链末端的ddNTP不能再与其它游离核苷三磷酸形成3，5-碳酸二酯键，导致ddNTP一旦连接到子链末端，子链便停止延伸。【小问1详解】将碎片化的DNA片段连接到质粒载体中，需要用到限制性内切酶将DNA和质粒切出黏性末端，用到DNA连接酶将DNA片段连接起来。【小问2详解】ddNTP含有C、H、O、N、P元素，了和蛋白质区分开来，选用32P进行标记ddNTP。【小问3详解】用凝胶电泳方法检测DNA分子，在同一电场、同一凝胶中，DNA分子在电场中的迁移速度主

116、要与DNA分子的大小有关，DNA分子越大，迁移速率越慢，反之则越快，所以在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度有关。【小问4详解】PCR的基本原理是DNA的半保留复制，即在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链。在DNA复制子链延伸过程中，ddNTP一旦连接到子链末端，子链便停止延伸，其原因是连接到子链末端的ddNTP不能再与其它游离核苷三磷酸形成3，5-碳酸二酯键。(2023届浙江省十校联盟高三第三次联考)17. 我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）

117、及其激活基因（sfp）构建基因表达载体（如下图），通过农杆菌转化法导入白玫瑰细胞中，获得蓝玫瑰。下列叙述错误的是（ ）A. 表达载体中sfp和idgS具有各自的启动子，表达相互独立B. 可以从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgS基因C. 在构建表达载体时所需的限制酶是Pme、BamH、Spe、SacD. 若受体白玫瑰细胞不变蓝，则可说明sfp和idgS未导入或导入后未成功表达【答案】C【解析】【分析】分析题图可知，靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）被插入到质粒的不同位置。【详解】A、分析题图可知，表达载体中sfp的启动子为启动子1，idgS的启动子为启动子2，两者表达相互独立，

118、A正确；B、获取目的基因的方法有利用DNA杂交技术从链霉菌的基因文库中获取sfp和idgS，B正确；C、分析题图可知，根据基因插入位置，在构建表达载体时所需的限制酶是BamHI、SpeI、SacI，C错误；D、若受体白玫瑰细胞不变蓝，可能sfp和idgS未成功导入或表达不成功，D正确。故选C。(2023届浙江省十校联盟高三第三次联考)24. 含有pRiA4质粒的发根农杆菌能诱导植物体长出发根，特别适合规模化生产从根中提取的物质如丹参酮，为了探究MYB98基因（丹参酮合成调控基因）对产量的影响，研究人员进行了如下操作：（1）上图所示的“重组”步骤中，目的基因应选择_。A. 丹参酮合成基因B. 链

119、霉素抗性基因C. 潮霉素抗性基因D. MYB98基因（2）要确定图中的“导入”是否成功，_（“立即”或“培养一段时间后”）将含发根农杆菌的菌液_，再接种于添加了_的固体培养基上，也可借助_技术进行检测，后者还可检测目的基因是否在发根农杆菌中完成转录。（3）在“感染”步骤中，含有目基因的发根农杆菌侵染经_处理的丹参叶片细胞，目的基因整合到叶片细胞的_中。之后对丹参叶片进行_处理，以利于叶片组织的存活。（4）图中的目的基因在丹参的_细胞中进行表达，该转基因即获得了成功。若要分离的基因表达产物可用_法，其原理是根据蛋白质分子的电荷、_及形状不同，在电场中的_不同而实现分离。丹参酮具有抑菌消炎等功能，

120、其作为丹参的_，并非丹参生命活动必需的物质。（5）取丹参植株叶片组织，用酶解法得到大量单个细胞进行植物组织培养，该过程_（“需要”或“不需要”或“不确定”）经历愈伤组织阶段，得到的成活后代中，有一些植株茎秆特别粗壮，科研人员认为其很可能是多倍体，可通过_进行确定。【答案】（1）D （2） . 培养一段时间后 . 稀释 . 潮霉素 . 核酸分子杂交 （3） . 消毒 . 染色体DNA（基因组） . 脱菌/除菌/除去农杆菌 （4） . 根 . （凝胶）电泳 . 大小 . 移动速率 . 次级代谢（或次生代谢）产物 （5） . 需要 . 分析染色体组型（分析染色体数目）【解析】【分析】基因工程的步骤：

121、目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。【小问1详解】根据题意可知，图示过程为了为了探究MYB98基因对产量的影响，所以目的基因应选择MYB98基因。【小问2详解】据图可知，运载目的基因的载体中有潮霉素抗性基因，且结构完整；接种方式是稀释涂布平板法。培养一段时间后将含发根农杆菌的菌液稀释，接种于添加潮

122、霉素的固体培养基上，也可以借助核酸分子杂交技术检测目的基因是否在发根农杆菌中完成转录，通过以上方式来确定图中的“导入”是否成功。【小问3详解】在“感染”步骤中，含有目的基因的发根农杆菌侵染经消毒处理的丹参叶片细胞，目的基因整合到叶片细胞的染色体DNA中，之后对丹参叶片进行除去农杆菌处理，以利于叶片组织的存活。【小问4详解】根据“从根中提取的物质如丹参酮”可知，图中的目的基因在丹参的根细胞中进行表达，该转基因即获得了成功。基因表达的产物是蛋白质，分离蛋白质可用凝胶电泳法，原理是根据蛋白质分子的电荷、大小及形状不同，在电场中的移动速率不同而实现分离。丹参酮具有抑菌消炎等功能，其作为丹参的次级代谢产

123、物，并非丹参生命活动必需的物质。【小问5详解】植物组织培养过程需要经历愈伤组织阶段。多倍体植株含有多个染色体组，可通过分析染色体组型进行确定。(2023届重庆市渝中区重点中学高三二轮复习综合卷)16. 某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，来表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是（ ）A. 导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒B. 研究过程需要使用限制酶、DNA连接酶和运载体这些专门的工具酶C. 可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒

124、D. 在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌【答案】D【解析】【分析】基因工程需要三种工具：限制酶、DNA连接酶以及载体。【详解】A、导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A错误；B、构建基因表达载体过程中需要限制酶和DNA连接酶，运载体不属于酶，B错误；C、由于目的基因要插入基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，即工程菌不能抗氨苄青霉素，因此不能用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒，C错误；D、由于目的基因要插入基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，即工程菌不能抗氨苄青霉素，在含氨苄青霉素培养基中不能生长，而重组质粒中抗链霉素基因完好，能表达，在含

125、链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌，D正确。故选D。(安徽省阜阳市2022-2023学年高三下学期开学考试理综)11. 回答下列（一）、（二）小题：（一）甜瓣子是豆瓣酱的重要成分之一，其生产工艺如下图所示：回答下面相关问题：（1）甜瓣子生产技术属于传统发酵技术。传统发酵技术利用的微生物通常来源于_。（2）发酵工程与传统发酵技术相比，产品种类更加丰富，产量和质量明显提高。原因是：通过纯培养来获得微生物纯培养物，常用的方法有_和_；进行纯培养时，人们按照微生物对营养物质的不同需求配制培养基；无菌技术围绕防止_而展开，主要包括_。（二）新冠病毒核酸检测一般流程如下图，请回答下面相关的

126、问题：（3）检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取qPCR法。为确保检测的准确性，在设计PCR引物时必须注意：用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸，过短会导致_，过长则会使反应体系有关步骤温度提高，从而超过_酶的最适温度；引物3端的碱基最佳选择是_（填“G和C”或“A和T”），这样形成的碱基配对比较稳定，引物的“5”端，可以被修饰，如附加限制酶位点等。（4）常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。获得蛋白疫苗一般需要用到动物细胞培养技术。进行动物细胞培养需要满足的条件有：营养条件；无菌、无毒的环境；适宜的_；适宜的_。【答案】（1）原材料中天然存在的微生物或利用前一次发酵保存下来

127、的发酵物中的微生物 （2） . 稀释涂布平板法 . 平板划线法 . 杂菌污染 . 消毒和灭菌 （3） . 特异性差 . 耐高温的DNA聚合/Taq（酶） . G和C （4） . 温度、pH（酸碱度）和渗透压 . 气体环境【解析】【分析】微生物常见的接种的方法：平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。【小问1详解】传统发酵技术利用的微生物通常来源于原材料中天然存在的微生物或利用前

128、一次发酵保存下来的发酵物中的微生物。【小问2详解】发酵工程中获得纯培养物的方法有平板划线法（进行连续划线，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落）和稀释涂布平板法（将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落）；无菌技术的关键是防止杂菌污染，主要通过消毒和灭菌实现。【小问3详解】PCR是一项体外扩增DNA的技术，该技术的前提是要有一对引物，引物可以通过碱基互补配对的方式与模板和子代DNA进行配对和连接，有特异性，故设计PCR引物时必须注意：用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸，过短会导致特异性差；酶作用的发挥需要适宜的温度，引物过长则会使反应体系有

129、关步骤温度提高，从而超过耐高温的DNA聚合/Taq酶的最适温度；由于DNA分子中A和T之间有2个氢键，G和C之间有3个氢键，G和C含量越多，DNA越稳定，故引物3端的碱基最佳选择是G和C这样形成的碱基配对比较稳定。【小问4详解】进行动物细胞培养需要满足的条件有：营养条件；无菌、无毒的环境；适宜的温度、pH（酸碱度）和渗透压；适宜的气体环境（95%的空气和5%的二氧化碳）。(安徽省六校教育研究会2022-2023学年高三下学期入学素质测试理综)11. 有种被称为“黑寡妇”的蜘蛛吐出的丝比已知的任何蛛丝的强度都高，用这种蜘蛛丝织成的布比制造防弹背心所用的纤维的强度还高得多。科学家们把“黑寡妇”蜘蛛

130、体内产生的蜘蛛丝蛋白的基因，巧妙地移植到山羊受精卵的细胞核内，培育出转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器，并用相应的技术获得了坚韧程度极强的蜘蛛丝蛋白，科学家给这种物质取名叫“生物钢”。其过程如下，请回答下列问题：（1）通过过程获得的蜘蛛丝蛋白基因可以利用_技术进行大量的扩增，扩增时需要设计相应的引物，引物设计的依据是_。（2）过程科学家通过_方法将蜘蛛丝蛋白基因导入山羊的受精卵中，并需要筛选性染色体组成为_的受精卵进行培养，过程还必须经过早期胚胎培养、_等胚胎工程的技术手段，进而培育出转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器。（3）基因工程操作的的核心步骤是_，其目的是_，并且可以遗传给下一代。为此，需要在

131、蜘蛛丝蛋白基因的上游加上启动子，对该启动子的要求是_。（4）转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器生产的“生物钢”坚韧程度极强，可替代高强度包装塑料和商业用渔网，请从环境保护的角度考虑其优点是_。【答案】（1） . PCR . 一段已知的蜘蛛丝蛋白基因的脱氧核苷酸序列 （2） . 显微注射法 . XX . 胚胎移植 （3） . 基因表达载体的构建 . 使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达 . 能使蜘蛛丝蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达 （4）可以被生物降解，不会造成环境污染【解析】【分析】PCR是一项体外合成DNA的技术，利用的原理是DNA的复制。【小问1详解】PCR是一项体外合成DNA的技术，过程获得

132、的蜘蛛丝蛋白基因可以利用PCR技术进行大量的扩增，扩增时需要设计相应的引物，引物设计的依据是一段已知的蜘蛛丝蛋白基因的脱氧核苷酸序列。【小问2详解】过程将目的基因导入动物细胞一般采用显微注射法。科学家的目的是培育出转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器，所以需要筛选性染色体组成为XX的受精卵进行培养，过程还必须经过早期胚胎培养、胚胎移植等胚胎工程的技术手段，进而培育出转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器。【小问3详解】基因工程操作的核心步骤是基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达并且可以遗传给下一代，需要在蜘蛛丝蛋白基因的上游加上启动子，启动子是基因转录的起点，所以启动子能使蜘蛛丝

133、蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达。【小问4详解】转基因“蜘蛛羊”乳腺生物反应器生产的“生物钢”的本质属于蛋白质，可以被生物降解，不会造成环境污染。(广东省六校2022-2023学年高三下学期第四次联考)21. 1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞

134、中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：（1）由于密码子具有_ ，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。_（填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。（2）图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶_的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5_3。（

135、3）-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经_（处理方法），大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和Xgal的培养基上筛选出_色的菌落即为工程菌种。（4）科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发_推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列。【答案】（1） . 简并性 . AB和BCA （2） . Xho和Mun . -CTCGAGCCTTTCAGCTCA- （3） . 钙离子处理法 . 白 （4）设计预期的蛋白质结构

136、【解析】【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。【小问1详解】AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，由于密码子具有简并性，所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。胰岛素基因存在于所有细胞中，但只能在胰岛B细胞中表达，结合题意“BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段”可知，BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA；在基因的结构中，启动子在非编码区，是不会被转录和翻译的，根据

137、题干信息“AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素，故由AB法中的“胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列”，和BCA法中的“胰岛B细胞中的mRNA”得到的目的基因中均不含人胰岛素基因启动子。【小问2详解】根据图2，对于目的基因，SalI和NheI的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoI和MunI和EcoRI中选择；同时质粒上EcoRI的其中一个作用位点是在标记基因上，所以只能选择XhoI和MunI两种限制酶，则需要在设计PCR引物时可添加限制酶XhoI和MunI的

138、识别序列。已知胰岛素基因左端处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，在设计PCR引物时需要添加限制酶XhoI和MunI的识别序列，根据两种酶在质粒上的位置上可知，XhoI的识别序列需要添加在目的基因左侧、MunI的识别序列需要添加在目的基因右侧，已知胰岛素基因左端处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，由于DNA合成时，新链的延伸方向是：53，即其中一种引物与模板链3端（处互补的位置）碱基互补配对，同时该引物序列需要包含XhoI的识别序列，所以其中一种引物设计的序列是5CTCGAGCCTTTCAGCTCA3。【小问3详解】将目的基因导入微生物细胞常用的方法是钙离子处理法，使其处于感受态

139、，将目的基因的插入的位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生-半乳糖苷酶，根据题干信息“-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上应选择白色的菌落。【小问4详解】蛋白质工程的途径：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列。(广东省清远市清新区部分学校2022-2023学年高三2月联考)21. 维生素A在体内转化为11-顺式视黄醛后，与视网膜特定细

140、胞中的视蛋白结合成视紫红质。视紫红质接受光信号后，11-顺式视黄醛转变为全反式视黄醛，视紫红质构象发生变化，激活细胞内的信号通路，最终产生视觉。全反式视黄醛与视蛋白脱离，经复杂的转运和酶促反应，再度转变为11-顺式视黄醛而被重复利用。最新研究表明，一种G蛋白偶联受体RGR可能参与了视觉产生的某些过程。为研究RGR的作用机理，某研究小组利用基因工程培育出含RGR反义基因（反义基因是通过原基因反向连接在载体的启动子和终止子之间，其转录出的mRNA与原基因转录出的mRNA互补配对）的转基因小鼠（rgr），研究该基因的功能。回答下列问题：（1）为构建RGR反义基因重组载体，需先设计引物，通过PCR技术

141、特异性扩增RGR反义基因。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，即在引物A的_（填“3端”或“5端”）添加_限制酶识别序列，在引物B添加_限制酶识别序列。（2）培养转基因小鼠过程中，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是_，常用的受体细胞是_，选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分，还需要添加_起筛选作用。（3）研究人员将正常小鼠（WT）和转基因小鼠（rgr）都平均分成两组，一组在黑暗中饲养12h，另一组在光照下饲养12h；随后测定小鼠眼睛中11-顺式视黄醛、全反式视黄醛和视紫红质的含量，结果如图所示。据图分析，光照条件下RGR的作用机理可能是_。【答案】（1） .

142、 5端 . BamH . EcoR （2） . 显微注射法 . 受精卵 . 四环素 （3）RGR通过促进全反式视黄醛转化为11-顺式视黄醛，进而增加视紫红质的形成【解析】【分析】PCR是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR进行扩增DNA的前提是已知一段核苷酸序列。将目的基因导入到动物细胞常用的方法为显微注射法。【详解】（1）若通过PCR技术增加限制酶序列，需要引物的5端添加相关序列；利用基因工程构建RGR反义基因表达载体时，需要将目的基因RGR反向连接在基因表达载体上，因此在引物A添加BamH限制酶识别序列，在引物B添加EcoR限制酶识别序列。（2）转基因动物常用的受体细胞是受精卵，将基因表达

143、载体导入受体细胞常用的方法是显微注射法。据图可知，基因表达载体含有四环素抗性基因，因此选择培养基中需要添加四环素。（3）根据题干信息可知，11-顺式视黄醛与视蛋白结合成视紫红质，视紫红质接受光信号后，11-顺式视黄醛转变为全反式视黄醛，全反式视黄醛与视蛋白脱离转变为11-顺式视黄醛；依据图示信息可知，光照条件下，与WT相比，rgr的11-顺式视黄醛量少，全反式视黄醛增加，视紫红质减少，说明全反式视黄醛转化为11-顺式视黄醛受阻，导致视紫红质形成减少，因为rgr含RGR反义基因，不能表达RGR，可见RGR通过促进全反式视黄醛转化为11-顺式视黄醛，进而增加视紫红质的形成。(广东省汕头市潮南区20

144、22-2023学年高三下学期期初摸底考试)21. 2017年CAR-T疗法获批可用于癌症治疗。其核心是将具有肿瘤识别功能的CAR基因整合到人体T淋巴细胞，形成能准确定位并杀死癌细胞的CAR-T细胞，请回答下列问题：（1）已知CAR基因的全部序列，科研人员通过_法和PCR技术可获得大量该基因片段。在PCR反应体系中除模板外还需加入_。（2）治疗基本过程是：分离患者T细胞并构建CAR-慢病毒运载体体外基因转移形成CAR-T细胞筛选、培养CAR-T细胞输入患者体内，该疗法属于_治疗，该运载体进入人体细胞的方式通常是_。该方法采用的是自身T细胞，而不用异体T细胞，其原因是_。（3）为检查CAR基因能否

145、在T细胞中翻译成蛋白质，可采用_法检测，CAR-T细胞培养所需CO2的主要作用是_，传代培养时，贴满瓶壁的细胞需要用_处理后再进行分瓶培养。【答案】（1） . 人工合成（或化学合成） . 引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸 （2） . 体外基因 . 胞吞 . 避免发生排斥反应 （3） . 抗原-抗体杂交 . 维持培养液的pH . 胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）【解析】【分析】1、获得目的基因通常有两种办法，如果目的基因的序列是已知的，我们可以用化学方法合成目的基因，或者用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因；如果目的基因的核苷酸序列是未知的，我们可以建立一个包括目的基因在内的基因文库，把

146、DNA分子的所有基因都包括在这个基因文库里面。2、基因治疗把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，分为体内基因治疗和体外基因治疗两种类型。先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内，这种方法称为体外基因治疗。直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法叫做体内基因治疗。【小问1详解】由于CAR基因的全部序列已知，科研人员可以用人工合成（或化学合成）或者PCR技术获得大量该基因片段。在PCR反应体系中加入作为模板的DNA序列、与计划获得的目的基因双链各一端序列相互补的两个DNA引物、耐

147、高温的DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸。【小问2详解】用CAR-T疗法治疗癌症的基本过程可知，该疗法属于体外基因治疗。该运载体进入人体细胞的方式通常是胞吞。该方法采用的是自身T细胞，而不用异体T细胞，其原因是避免发生排斥反应。【小问3详解】为检查CAR基因能否在T细胞中翻译成蛋白质，可从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。CAR-T细胞属于动物细胞，培养所需CO2的主要作用是维持培养液的pH。传代培养时，贴满瓶壁的细胞需要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理后再进行分瓶培养。(河北省邯郸市部分学校2022-2023学年高三下学期开学考

148、试)23. 新冠疫苗在全球抗击新冠疫情中做出巨大贡献，疫苗种类主要有灭活疫苗（将病毒灭活处理，使其失去传染性和致病性，但保留了抗原性）、亚单位疫苗（通过各种方式培养病毒抗原蛋白，如S蛋白，之后经过纯化制备而成），病毒载体疫苗（通过基因工程技术将表达抗原蛋白的基因移植到其他病毒上进行培养，让新的病毒产生新冠病毒的抗原蛋白）、核酸疫苗（通过基因工程技术制作新冠病毒的核酸，让病毒抗原在机体内制造抗原）等种类。如图为有关疫苗的制备过程示意图，回答下列问题：（1）准确，快速判断个体是否被新冠病毒感染是实现动态清零的前提。人体感染新冠病毒初期，核酸检测阳性，抗体检测阴性，主要原因是_免疫尚未被激活。（2）

149、过程不能用普通培养基培养，原因是_。疫苗I发挥免疫预防的机理是_。（3）过程需要在_酶的催化下才能完成。过程构建基因表达载体时通常不采用同一种相同的限制酶，而是采用双酶切法，双酶切的优点是_。（4）过程通常使用_处理受体菌，使其处于_（生理状态）。（5）疫苗和疫苗V进入人体后，均能发挥免疫预防作用，二者产生S蛋白的过程不同，表现为_。若疫苗V为腺病毒疫苗，构建腺病毒载体时需将腺病毒的复制基因敲除，目的是_。【答案】（1）体液 （2） . 新冠病毒只有寄生在宿主细胞中才能增殖#新冠病毒在普通培养基中不能增殖 . 病毒抗原注入人体后，刺激B淋巴细胞，B淋巴细胞增殖分化成记忆细胞和浆细胞，后者产生抗

150、体，记忆细胞和抗体起到免疫预防的作用 （3） . 逆转录 . 防止目的基因及质粒各自自身连接，有利于目的基因的正向连接 （4） . Ca2+ . 感受态 （5） . 疫苗进入细胞核进行转录，然后在细胞质中翻译，产生S蛋白；疫苗V进入细胞质，经过翻译产生S蛋白，引起免疫反应 . 使腺病毒的核酸无法复制，无法在人体细胞中增殖【解析】【分析】1、基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的获取；第二步：基因表达载体的构建（核心）；第三步：将目的基因导入受体细胞；第四步：目的基因的检测和表达。2、分析题图可知，分别是病毒培养的过程，逆转录过程，构建基因表达载体的过程和将目的基因导入受体细胞的过程。【小问

151、1详解】人体感染新冠病毒初期，由于感染者体内存在病毒，故核酸检测阳性，但病毒抗原还未激发人体产生体液免疫，故抗体检测阴性。【小问2详解】过程是病毒培养的过程，不能用普通培养基培养，原因是新冠病毒没有细胞结构，只有寄生在宿主细胞中才能增殖。疫苗I是由灭活病毒制成，不能感染宿主细胞，而游离在内环境中，故发挥免疫预防的机理是病毒抗原注入人体后，激活体液免疫，刺激B细胞，B细胞增殖分化成记忆细胞和浆细胞，后者产生抗体，记忆细胞和抗体起到免疫预防的作用。【小问3详解】过程是逆转录过程，需要在逆转录酶的催化下才能完成。过程构建基因表达载体时通常不采用同一种相同的限制酶，而是采用双酶切法，双酶切的优点是不同

152、的限制酶处理后，黏性末端往往不同，可以防止目的基因及质粒各自自身连接，有利于目的基因的正向连接。【小问4详解】过程是将目的基因导入受体细胞的过程，通常使用Ca2+处理受体菌，使其处于感受态，更容易吸收外源DNA。【小问5详解】疫苗是含S蛋白基因的重组DNA，会进入细胞核进行转录，然后在细胞质中翻译，产生S蛋白作为抗原，而疫苗V是S蛋白基因的mRNA，进入细胞质，经过翻译产生S蛋白，引起免疫反应。若疫苗V为腺病毒疫苗，构建腺病毒载体时需将腺病毒的复制基因敲除，目的是使腺病毒的核酸无法在人体细胞中进行复制，确保腺病毒无法在人体细胞中增殖。(河北省石家庄市部分学校2022-2023学年高三下学期开学

153、考试)13. 新冠病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA通过RT-PCR（反转录酶聚合酶链式反应）技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因（图1）构建基因表达载体（图2）导入CHO细胞并培养提取并纯化RBD蛋白制成疫苗。图3为利用电泳技术对PCR的产物进行纯度鉴定，1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照组，3号泳道为实验组。下列相关叙述错误的是（ ）A 利用RT-PCR技术获取RBD蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶B. 利用PCR扩增含有限制酶切点的RB

154、D蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5C. 2号泳道是以（提纯的）RBD蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组D. 为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcoRI切割【答案】D【解析】【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制，需要条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶），过程包括：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。【详解】A、RT-PCR技术是将RNA的反转录和c

155、DNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入逆转录酶、Taq酶，A正确；B、引物与模板链的3端碱基互补配对，故引物1、引物2、引物7和引物8不合适，扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有限制酶的酶切位点，故引物3和引物6不合适，故选引物4和引物5，B正确；C、PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组，C正确；D、质粒上没有Sma酶切位点，且若使用EcoR酶切，易造成目的基因和质粒自身环化，故应该选择BamH和Hind，D错误。故选D。(河南省安阳市重点高

156、中2022-2023学年高三下学期开学摸底联考理综)12. 心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命唯一有效的手段，然而心脏移植过程中会发生缺血再灌注损伤（IRI），可能导致心脏坏死。研究发现，IRI通过促进Caspase8等一系列凋亡基因的表达，导致细胞凋亡最终引起器官损伤。根据Caspase8基因合成的小干扰RNA（siRNA）可以使Caspase8基因沉默，有效抑制IRI所致的器官损伤。图1是利用猪的心肌细胞开展siRNA作用研究的示意图，图2是此研究可能用到的4种限制酶及其切期位点。回答下列问题：（1）图1中步骤构建重组质粒需要使用多种工具酶。常用的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4

157、DNA连接酶。图2中_酶切割后的DNA片段可以用EcoliDNA连接酶连接，图中_酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是_。（2）图1中步骤将重组质粒导入猪的心肌细胞最常用的方法是_。siRNA对应DNA序列在心肌细胞中表达产生siRNA的步骤称为_。siRNA与RISC组装形成基因沉默复合物，通过抑制基因表达的_过程，使Caspase8基因沉默，从而降低IRI引起的细胞凋亡。（3）研究人员根据Caspase8基因的碱基序列，设计了三种序列分别导入猪的心肌细胞，通过测定靶基因Caspase8的mRNA含量来确定最优序列。测定

158、mRNA含量时，需提取心肌细胞的总RNA，经过过程得到cDNA，再进行PCR扩增，测定PCR产物量，结果如_图3所示。据此判断最优序列是_。（4）选用猪的心肌细胞作受体细胞是因为猪在基因、解剖结构、生理生化和免疫反应等方面与人类极为相似。为了解决心脏移植供体短缺问题，许多科学家正在研究用猪心脏代替人的心脏。你认为将猪心脏移植到人体面临的最大挑战是_。【答案】（1） . EcoR、Pst . EcoR、Sma、Pst、EcoRV . 磷酸二酯键 （2） . 显微注射法 . 转录 . 翻译 （3） . 逆转录 . 序列2 （4）免疫排斥反应【解析】【分析】图1中为目的基因的获取，为基因表达载体的构

159、建，为将目的基因导入受体细胞，为转录。【小问1详解】限制酶EcoRI和Pst切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末端，因此图中EcoR和Pst切割后的DNA片段（具有黏性末端）可以用EcoliDNA连接酶连接，EcoRI、Pst、Sma和EcoRV切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。【小问2详解】将重组质粒导入动物细胞常采用显微注射法，步骤以DNA为模板合成RNA，为转录过程。mRNA是翻译的模板，据图1可知，基因沉默复合物作用于Caspase8mRNA，抑制了基因表达的翻译过程，使Caspase8基因沉默。【小问3详解】测定mRNA含量时，需提取细胞总RNA，经过逆转录过程得到cDNA，再进行PCR扩增，通过PCR产物的量间接反映细胞中相关基因的mRNA含量；据图3可知，在序列2作用下，PCR产物量最少，推测Caspase8的mRNA含量最低，表明其抑制效果最好，是最优序列。【小问4详解】对于人体而言，猪的器官属于外来物质，免疫系统会把外来器官当作抗原成分进行攻击，故免疫排斥反应是将猪心脏移植到人体面临的最大挑战。