2012高二生物：1.2《基因工程的基本操作程序》精品课件（新人教版选修3）.ppt

1、1.2 基因工程的基本操作程序团风中学吴建兵1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是_编码蛋白质的基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成阅读教材P8-11如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。1、从基因文库中获取目的基因（1）.基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生

2、物的不同基因，称为基因文库。种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构调控遗传信息表达,上游的RNA聚合酶结合位点:启动子真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调

3、控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。非编码序列：包括非编码区和内含子非编码序列：包括非编码区和内含子与RNA聚合酶结合位点原核细胞真核细胞不同点编码区是_的，边_边_编码区是间隔的、_的，先_后_相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码转录翻译转录翻译1下列关于基因结构的认识中，正确的是（）A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是（）A

4、编码区都有能编码蛋白质的序列B编码区都是连续的C非编码区都能调控遗传信息的表达D非编码区都有RNA聚合酶结合的位点DACD提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存（2）.基因文库的构建方法基因组文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存 cDNA文库的构建-逆转录法：mRNARNADNA杂合双链单链DNA双链DNA逆转录（cDNA）DNA聚合酶真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？

5、原核生物基因呢？思考？编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子（3）构建基因文库的目的怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法直接分离法(鸟枪法)直接分离法供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶受体细胞产生

6、特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(鸟枪法)回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些？多用于原核生物某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）基因组DNA文库与cDNA文库的比较某种生物某个时期的mRNA基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组DNA文库与cDNA文库的比较构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文

7、库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC2、利用PCR技术扩增目的基因 概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术。原理：_多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制5555333355335533DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA复制复制的条件的条件：模板DNA、脱氧核苷酸、解旋酶、引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物PCR技术v 原理：v 前提：v 原料：v 优点过程：PCR扩增仪DNA复制已知目的

8、基因的一段核苷酸序列：以_方式扩增，在短时间内大量扩增目的基因指数模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子变性复性延伸过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍一过程：PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数(2(2nn)形式扩增形式扩增方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）条件：_

9、、_、_、_、前提条件:_ 结果：模板DNA(含目的基因)四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶指数2n使_在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷酸序列含目的基因的DNA片段DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论

10、上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循环次数)（24-1）2=30蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测3、人工合成法：在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成人工合成法（真核生物）推测推测单链DNA合成那么原核生物和真核生物基因结构有没有区别呢？一、目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一

11、种生物的部分基因，如：cDNA文库课堂小结：2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、CDNA文库法D、聚合酶链反应3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个A.540B.8100C.17280D.75601.加热至95摄氏度的目的是使DNA中的断裂，这一过程

12、在细胞内是通过 解旋酶的作用来完成的。2.当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料，遵循的原则是。3.Taq酶的特点是（）A.耐强酸B.耐强碱C.耐高温D.最适温度37摄氏度4.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温ABCDD在基因工程中，把选出的目的基因（共

13、1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个B.8100个C.17280个D.7560个B在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、cDNA文库法D、聚合酶链反应下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成ABC DAD（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目的基因，使其产生_ _。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，

14、形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:v基因表达载体的构建质粒目的基因 限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种Hin d限制性酶Hin dIIIHin dIII目的DNA质粒构建表达载体四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因DNA连接酶人类胰岛素的基因2.基因表达载体的组成：它们所处的位置和有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞3、基因表达载体的作用a、使目的基因

15、在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物

16、存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意目的基因与运载体结合所需的条件有同一种限制酶 具有抗性基因的质粒RNA聚合酶目的基因DNA连接酶四种脱氧核苷酸ATP ABCD（多选）一个基因表达载

17、体的构建应包括A目的基因B启动子C终止子D标记基因ABCDD下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A 常用的受体细胞：原核生物：大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌真核生物：酵母菌和动植物细胞 将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。v将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞（

18、1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞整合 植物细胞染色体DNA表达新性状转入 农杆菌整合到染色体上转移至受体细胞（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用于单子叶植物的转化方法（2）基因枪法微弹轰击法特点：成本高适用于适用于单子叶植物单子叶植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊

19、。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国转我国转基因抗基因抗虫棉就虫棉就是用这是用这种方法种方法获得获得2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫早期胚胎新性状动物2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与

20、感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理植物基因工程动物基因工程微生物基因工程常用方法受体细胞比较目的基因导入不同细胞的方法农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法体细胞受精卵原核细胞1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是A结构简单、操作方便B繁殖速度快C遗传物质含量少、简单D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌 枯草杆菌 支原体动植物细胞ABCDBD3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基

21、因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达Cv目的基因的表达和检测抗虫鉴定 抗病鉴定活性鉴定等抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法DNA-RNADNA-RNA分子杂交法分子杂交法DNADNA分子杂交法分子杂交法受体是否具有受体是否具有转基因特征转基因特征个体个体水平水平目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否导入目的基因是否导入分子分子水平水平方法方法检测对象检测对象检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法 DNA分子杂交表达检测转录检测分子杂交翻译检测抗原抗体杂交分子检

22、测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定v目的基因的表达和检测（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤).首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。P15思考与探究（二）、鉴定（

23、个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分 子 杂 交方法:抗原抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质ABCDC采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注

24、射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养ABCDC归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因u 从基因文库u 利用PCRu 化学方法人工合成2.构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理4.目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译u 鉴定：练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。

25、（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术，该技术的核心是和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、

26、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶AC基因工程是在基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工的。在基因分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是AA、人工合成目的基因、人工合成目的基因BB、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达CC、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细

27、胞DD、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”ABCD培养培养培养导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素的完全培养基含有四环素的完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆菌Ca2+处理细胞形成感受态细胞检测（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素抗性基因质粒只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌完全培养基导入接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌的受体细胞含有目的基因四环素抗性基因四环素抗性基因存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？存活导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明：不存活含有四环素的完全培养基证明：大肠杆菌含抗四环素基因证明：大肠杆菌的受体细胞含有目的基因四环素抗性基因四环素抗性基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？