常见真菌毒素的解读及其检测方案.pdf

1、常见真菌毒素的解读及其检测方案真菌毒素在自然界中广泛存在，有数据统计，全世界每年约有 25%的食物受到不同程度的真菌毒素污染，每年由于霉变污染导致真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿美元。由此可见，真菌毒素会对谷物类食品的生产者和消费者造成巨大损害。我国谷物霉变主要发生在长江以南地区，每年约使粮食减产 3%7%。据调查，除粮食、饲料外，在油料作物、种子、水果、干果、蔬菜、调味品、烟草、麻类、乳和乳制品、发酵产品中都发现了不同程度的真菌毒素，其引起的疾病及伤害可以说给人们带来了巨大的人员伤亡和财产损失。1 什么是真菌毒素真菌毒素是真菌在适宜温度、湿度条件下产生的次级代谢产物，在粮食和饲料

2、卫生安全领域又俗称为霉菌毒素。真菌为喜好氧气的微生物，在厌氧条件下几乎不能生存，因此谷物贮存时使用抽真空或充氮气等方法都能有效避免真菌毒素的滋生。目前，己经分离和鉴定出 400 多种真菌毒素，而在粮食行业中最常见的真菌毒素主要有 4 种，即黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和赫曲霉毒素 A。2 来源及特点2.1 真菌毒素的来源真菌毒素的来源大体可分为两个部分，即收获前真菌毒素的来源与收获后真菌毒素的来源。2.1.1 收获前真菌毒素的来源任何生长中的农作物，包括饲草和谷物等，都容易在受到真菌污染时产生真菌毒素。真菌在随农作物由田间向饲料加工厂再向饲料槽的转换过程中可能不会存活，即使有些真菌毒素被

3、完整地保留下来，但饲料原料看上去颜色及外观都不错，常见指标检测分析结果也不错，而往往就是这些“不错”的原料可能早就已经成为真菌毒素的避风港。2.1.2 收获后真菌毒素的来源收获后的农作物如果其贮存、运输、加工、保藏的外部环境满足真菌的生长条件，则真菌会继续生长产毒。粮食饲料在收获时未被充分干燥或贮运过程中温/湿度过高，粮食饲料上污染的真菌就会迅速生长，此时真菌毒素会一直积累叠加，最终危害动物机体而不自知。2.2 真菌毒素的特點2.2.1 高效性较低毒素浓度（g/kg）的真菌毒素即能产生明显毒性。在污染比较严重的几种真菌毒素中，黄曲霉毒素 B1（AFB1）具有强毒性是氰化钾的 10 倍、砒霜的

4、68 倍，被世界卫生组织的肿瘤研究机构列为类致癌物质。然而，AFB1的存在极为普遍在农作物和饲料中广泛存在，其主要损害肝脏功能并具有强烈的致癌、致畸、致突变作用，能引起肝癌，甚至诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。2.2.2 高稳定性低分子化合物非常稳定，可耐高温。黄曲霉素具有较为稳定的化学性质，对热不敏感即便在 100下暴露 20 小时也不能将其完全去除，只有在 280以上的高温下才能被破坏。2.2.3 富集性真菌毒素所具有的抗化学生物制剂及物理灭活作用可以帮助其在生物链中不断传播、富集原本残留在土壤中的真菌毒素会被后来种植的谷物吸收，从而引起更多真菌毒素污染及感染的问题。2.2.4

5、特异性分子结构不同，毒性相差较大。如黄曲霉毒素族有黄曲霉毒素 B1、B2、M1、M2，各毒素的毒性均不同。2.2.5 相加性两种以上的真菌毒素混合在一起造成的伤害远超单一毒素产生毒害作用的总和。由于农作物可能被几种真菌共同污染，因此饲料中可能同时存在多种真菌毒素。2.2.6 污染地域性动物饲料及农产品中真菌毒素的产生具有一定的地域性。例如，热带和亚热带区域是曲霉菌生长的最佳环境。尽管如此，饲料和农产品贸易的全球化导致真菌毒素在全世界范围内传播。2.2.7 隐蔽性真菌毒素检测时常受到小分子物质（如糖苷、葡糖苷酸、脂肪酸酯和蛋白质）的掩盖，这些小分子物质与真菌毒素结合在一起，导致检测值显示为错误的

6、阴性结果。最终，这些被掩盖的真菌毒素不能被传统的分析方法检测出来。但这些结合到真菌毒素上的分子可能在消化过程中被解除，从而释放出真菌毒素，危害动物及人体健康。3 四种常见的真菌毒素3.1 黄曲霉毒素黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，性质较为稳定，溶点为 268269，高温下可稳定存在，常规加热和巴氏杀菌均不能将其有效去除。已知的黄曲霉毒素有 20 多种，包括直接由真菌代谢产生的 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2，以及集体摄入黄曲霉毒素后所代谢产生的 AFM1 和 AFM2。其中，以 AFB1 最为常见且毒性最强是迄今为止已知毒性最强的物质之一。黄曲霉毒素 B1 具

7、有强致癌和致突变性，动物体肝脏为其主要损伤器官，可引发肝炎、肝坏死、肝硬化等疾病，最终造成肝衰竭甚至死亡，现已被国际癌症研究机构列为 I 类致癌物。黄曲霉毒素 B1 的污染范围较广，玉米、小麦、大豆、大米、花生、饲料及乳制品等农产品均可检出，其中，玉米、小麦、大豆和饲料受黄曲霉毒素 B1 的污染情况较为严重。在高温、高湿的热带和亚热带地区，农产品和食品中黄曲霉毒素具有较高的检出率；国外发达国家包括欧洲地区、北美、日本等地，食品、饲料、奶制品中的 AFB1超标率较低；中东及非洲等发展中国家的 AFB1 污染率较高。国外，黄曲霉毒素超标较为严重的食品为玉米，其黄曲霉毒素含量高时可达 4.8mg/k

8、g，超过限量 200 多倍。国外 AFM1 的污染情况与 AFB1 类似，发达国家或地区超标率非常低，而中东及非洲等发展中国家的 AFM1 超标率则相对较多；且国外有大量关于母乳中 AFM1 含量的报告。在我国，花生及制品、食用油、饼粕及饲料和玉米、大米等农产品中黄曲霉毒素污染比较严重，且欧盟的限量标准远低于我国标准，故已引发多起因黄曲霉毒素超标而导致的农产品国际贸易纠纷。如 2000 年我国出口到欧盟的花生约40%存在黄曲霉毒素超标情况，因而遭到退货或被迫转口贸易，致使我国农产品进出口贸易受到巨大损失，不仅使我国对欧盟的花生出口贸易严重受限，而且极大影响了其他地区消费者对我国花生质量安全的信

9、任，直接影响我国花生出口贸易的竞争力。3.2 呕吐毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），主要由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌和燕麦镰刀菌产生，是单端孢霉烯 B 族毒素。1973 年，Vesohder 从引起母猪拒食和呕吐的玉米中分离得到该毒素，并根据它能引发动物呕吐的特征将其定名为呕吐毒素（Vomitoxin，VT）。DON 是雪腐镰刀菌稀醇的脱氧衍生物，也是一种全球性的谷物污染物。DON 的主要产生菌是禾谷镰刀菌，其为小麦赤霉病与玉米穗腐病的重要病原菌，大多于低温、潮湿和收割季节，在谷物庄稼中慢慢生长。DON 一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，而在黑麦、高梁、大米中的浓度较低。DON 对粮谷

10、类的污染状况与产毒菌株、温度、湿度、通风、日照等因素有关。其热反应较为稳定，一般的烹调及加热不能破坏其毒性，但它对碱性环境比较敏感，用碳酸钠溶液洗涤粮食可除掉 70%左右的 DON。由于粮食中往往存在多种真菌毒素，因此會出现毒素间的协同作用、相加作用等不同情况。DON 与玉米赤霉烯酮存在协同作用，能够引起潜在的繁殖功能障碍。雪腐镰刀菌烯醇和 DON 存在相加作用，同时摄入这两种毒素的动物会出现较重的临床症状。3.3 玉米赤霉烯酮玉米赤霉烯酮（ZEN）是由多种镰刀菌（主要由禾谷镰刀产生）在代谢过程中产生的一种非类固醇结构产物。此外，玉米赤霉烯酮在许多高等植物体内存在，并作为植物体内的一种激素来调

11、控植物的生长，例如小麦、大豆、棉花等在开花时玉米赤霉烯酮也达到峰值。玉米赤霉烯酮可被胃肠道持续吸收，肝肠循环可使其在胃肠道滞留时间延长，其主要随粪便排出，少量可由乳汁排泄。ZEN 在动物体内与葡萄糖醛酸结合后还原为玉米赤霉烯醇，该毒素主要污染物为谷物及其制品，可发生于农作物的生长、收获、贮存和加工等各环节。湿度较高的环境条件下镰刀菌更易生长繁殖，因此雨量充沛、相对湿度较高的地区，玉米赤霉烯酮污染情况较为严重。玉米赤霉烯酮为雌激素类似物，急性毒性较低，主要作用于生殖系统，故具有生殖毒性，可造成生殖激素系统紊乱，严重影响动物机体的繁殖机能。3.4 赭曲霉毒素 A赭曲霉毒素是由曲霉属和青霉属的某些霉

12、菌结合产生的真菌毒素，主要有 7 种结构类似物，分别是赭曲霉毒素 A、赭曲霉毒素 B、赭曲霉毒素 C、赭曲霉毒素D、甲酯化的赭曲霉毒素 A 及甲酯化或乙酯化的赭曲霉毒素 B。从对谷物的污染率、污染水平及对人畜的毒性考虑，赭曲霉毒素 A 是其中最重要的且具有卫生学意义的霉菌代谢产物。赭曲霉素的污染范围较广，几乎可污染玉米、小麦在内的所有谷物。正常条件下，小麦和玉米受污染的机率较小，约 1%5%，其含量为 0.015mg/kg；大麦和燕麦被污染的机率较高，约为 10%，其含量一般在 0.1mg/kg 以下。4 维德维康真菌毒素检测方案-真菌毒素检测系统北京维德维康生物技术有限公司（以下简称“维德维

13、康”）是一家专注于食品中有害化合物残留快速检测技术、动物疫病快速诊断技术研究及相关产品开发的中关村高新技术企业、国家高新技术企业、国家火炬计划重点高新技术企业和北京市专利示范单位。多年来，维德维康深谙市场规律与用户切身需求，致力于为食品生产、加工、流通领域的企业及政府监管部门提供先进的检测技术、产品及综合解决方案。目前，维德维康拥有系统性的真菌毒素检测手段，能够为用户提供完善的真菌毒素解决方案和服务，现有检测产品包括：真菌毒素胶体金定性或半定量检测卡、酶联免疫吸附（Elisa）试剂盒和荧光定量快速检测卡，以及高效液相色普（HPLC）与液相色谱-串联质谱仪器确证平台。上述 3 种免疫学快速检测方

14、法的优势在于：均可使用 70%甲醇水统一提取粮食中常检的 4 项毒素（呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素 B1 和赭曲霉毒素 A），单次提取可同时检测多种真菌毒素，较大程度的减少了前处理的工作量，提高了检测效率。食品安全国家标准 GB 2761-2017 所规定的上述 4 项真菌毒素限量标准分别为：呕吐毒素1000ppb；玉米赤霉烯酮60ppb；黄曲霉毒素 B1520ppb；赭曲霉毒素 A5ppb。4.1 胶体金检测试纸条胶体金检测试纸条具备操作简单、检测时间短、不需要仪器设备进行结果读取的优点；但其只能进行定性或半定量检测，灵敏度相对较低，且结果判定易受主观因素影响。胶体金检测卡适用于大批量

15、样本的初次筛选，后续可使用 ELISA 或仪器方法进行验证。4.2 酶联免疫吸附检测试剂盒酶联免疫吸附检测试剂盒的操作相对复杂，检测结果易受人为操作影响，且检测时间长（30min），不适用于少量样本的检测（成本高、耗时长）。但该产品灵敏度相对较高，可借助于酶标仪读取并计算得到定量的检测数据，适用于大批量样本的同时检测。4.3 真菌毒素荧光定量快速检测系统根据粮食安全监测工作的实际需要，按照简单、快速、准确、便携和经济等原则，维德维康荧光定量快速检测系统集中整合了荧光定量快速检测卡、必要的前处理设备、荧光免疫定量分析仪和云端数据监管平台，将粮食真菌毒素的检测统一于相同的前处理操作，并与搭建的云端

16、监管平台结合链接，实现了“样品采集-样本处理-真菌毒素提取-定量检测-数据实时上传”，且该过程可以进行全程监管。4.3.1 真菌毒素荧光定量快速检测箱真菌毒素荧光定量快速检测箱包含多种日常使用的仪器：荧光免疫定量分析仪FQ-S2、检测卡孵育器、掌上离心机、粉碎机（毛刷）、旋涡振荡仪、天平（千分之一）、20200L 微量移液器、1001000L 微量移液器、15mL 微量移液器、称量勺/称量纸、100mL 量筒、计时器、10mL/50mL 离心管、1.5mL 离心管、1.5mL&10mL&50 mL 管架、200L 枪头/盒、1mL 枪头/盒、仪器使用说明书。4.3.2 荧光定量快速检测卡荧光定

17、量检测卡同时兼具了胶体金检测卡操作简便、检测时间短（8min），以及 Elisa 试剂盒灵敏度高、可定量的优点，还可借助于荧光免疫定量分析仪将检测结果直接实时传输至云端数据监管平台。检测原理为，将处理好的样品滴加至加样孔后，样品中的目标物与释放垫中的荧光微球标记抗体结合并向前层析，當达到检测区域后，检测线（T 线）上固定的抗原与剩余的部分荧光微球标记抗体结合，T 线上结合的荧光微球标记抗体量与样品中目标物的浓度成反比，C 线上结合的荧光标记物样品中待测物的含量无关。8min 层析结束后，使用荧光免疫定量分析仪读取 T 线和 C 线的荧光强度并计算 T/C 值，仪器结合 T/C 值和二维码上的标

18、准曲线即可计算出样品中待测物的含量。为满足用户的检测需求，维德维康在研发时将实际检测工作中的痛点问题纳入考量，荧光定量快速检测卡才有了无与伦比的检测优势：采用时间分辨荧光微球作为抗体标记物，检测灵敏度更高；时间分辨荧光的 Stokes 位移约 290nm，抗背景干扰能力强；附带的二维码包含检测项目、检测样本、检测限等信息；40温度层析，反应速度快，减少检测时间，提高检测效率；检测结果稳定性高，可保证在 510min 层析时间内结果稳定。4.3.3 荧光免疫定量分析仪（FQ-S2）荧光免疫定量分析仪（FQ-S2）有如下特点：仪器配置方面，8 寸 12001920 IPS 显示屏和 1.5GHz

19、八核处理器，2G 内存；操作系统方面，荧光免疫定量分析仪的操作软件支持自动检测，在线升级；信号识别方面，仪器可自动识别检测卡上的二维码信息，并进行检测的结果计算；存储空间方面，存储空间达 16GB，可保存海量的检测数据，便于结果查询；数据传输方面，检测数据可通过无线 WIFI 实时传输到云端数据监管平台；结果打印方面，仪器自带热敏打印机，检测结果可实时打印。4.3.4 云端数据监管平台维德维康监测监管系统能与检测仪器上传的数据交互，利用互联网技术实现检测数据实时上传，监管平台对检测数据进行处理分析和分类汇总，可实现食品安全关键点的信息化监控，构建省级、市级、区县级的数据化、信息化监测监督体系，为管理者提供强大的系统数据支撑。